科研 | J Exp Clin Cancer Res：YAP通过上调HMGB1促进神经胶质瘤的自噬和进展（国人佳作）
编译：微科盟橙子，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）在缺氧和营养缺乏的微环境中表现出较高的自噬活性，自噬在GBM的发生发展中起重要作用；然而，GBM进展中自噬的分子机制尚不清楚。YAP过表达增强了基础和诱导条件下胶质瘤细胞的自噬；此外，氯喹阻断自噬可以消除YAP对胶质瘤生长的促进作用。在机制上，YAP的过度表达促进了自噬调节因子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）从细胞核到细胞质的转录和易位。HMGB1的下调消除了YAP对自噬和胶质瘤生长的促进作用。此外，YAP和HMGB1的表达呈正相关，暗示临床GBM预后不良。YAP通过增强HMGB1介导的自噬作用促进胶质瘤的进展，表明YAP HMGB1轴是治疗GBM的一个可行的靶点。我们的研究揭示了化疗与药物自噬抑制相结合治疗YAP高表达GBM患者的可能性。
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实验设计
1. 首先检测YAP是否影响胶质瘤细胞中LC3-II和p62的蛋白水平。其次，免疫荧光检测GFP-LC3斑点的数量。此外，透射电子显微镜（TEM）检查自噬小泡（AVs）、自噬小体（APs）和自溶小体（ALs）。
2. 用Rap和自噬抑制剂CQ处理确定YAP是否影响诱导的自噬。
3. 通过EdU掺入法以及小鼠颅内胶质瘤模型检测YAP对胶质瘤进展的促进作用是否由自噬介导。
4. 利用iTraq蛋白质组学方法筛选可能介导YAP促进胶质瘤自噬的蛋白。
5. 通过EdU掺入试验和CCK8试验研究YAP对胶质瘤生长的促进作用是否由HMGB1介导。
6. 利用TCGA和CGGA数据库、western blotting以及免疫组化分析YAP和HMGB1在胶质瘤标本中的临床意义。
实验结果
1. YAP增强胶质瘤细胞自噬
在自噬的发展过程中，研究最广泛的自噬相关蛋白LC3B从LC3-I被加工成LC3-II，然后被磷脂酰乙醇胺修饰并结合到自噬液泡膜的表面，因此，LC3-II位于自噬前体和自噬体，被广泛认为是自噬诱导的标志物，其持续积累是自噬增强的反映。另外，选择性自噬产物p62在自噬过程中降解，其积累可作为抑制自噬的标志物。
为了探讨YAP在自噬中的作用，我们首先检测了YAP是否影响胶质瘤细胞中LC3-II和p62的蛋白水平。如图1a所示，与载体对照细胞相比，在YAP过表达后，LC3-II及其前体LC3-I的蛋白水平均升高，而p62水平降低；其次，在YAP过度表达后，GFP-LC3斑点的数量明显增加（图1b和c），表明YAP促进U251和U87细胞中的自噬体形成。此外，通过检测自噬的金标准透射电子显微镜（TEM）检查，我们发现YAP过表达的U251胶质瘤细胞中自噬小泡（AVs）、自噬小体（APs）和自溶小体（ALs）增加（图1d-f）。有趣的是，YAP过表达后溶酶体的数量也明显增加（图1g），表明YAP促进自噬体的成熟和降解。以上结果表明，YAP在基础条件下促进胶质瘤细胞自噬。
图1 YAP在基础条件下增强自噬
(a)在基础条件下，免疫印迹法检测过表达YAP的U251和U87细胞中LC3和p62表达水平。(b)过表达YAP的U251和U87细胞中表达GFP-LC3的荧光显微照片。(c)定量（b）中GFP-LC3点状物。(d)过表达YAP的U251细胞的电子显微照片。白色箭头表示具有双膜的自噬结构，称为自噬体（AP）；蓝色箭头表示具有单膜的自噬小泡（AV），其中含有正在降解的细胞溶质物质，称为自溶体（AL）；红色箭头表示溶酶体。（d）中过表达YAP的U251细胞中AVs（e，包括AP和AL）、AP和AL（f）以及溶酶体（g）的定量。
2. 在雷帕霉素或饥饿诱导的条件下，YAP增强自噬
为了确定YAP是否影响诱导的自噬，我们用Rap（200 nM）和自噬抑制剂CQ（20 μM）处理U251细胞。如图2a所示，在载体对照细胞中，雷帕霉素诱导后，LC3-II的蛋白水平升高，而p62的蛋白水平降低。更重要的是，YAP的过度表达显著地放大了上述结果，CQ治疗阻断了这一结果。由于自噬是一个动态的过程，我们利用活体细胞成像技术连续监测雷帕霉素诱导后GFP-LC3转染细胞的自噬过程。如图2b所示，YAP过表达细胞显示出比载体细胞更多的GFP-LC3簇。另外，在YAP过表达细胞中GFP-LC3点状结构的形成和消失速度也明显快于载体细胞。在营养剥夺（ND）诱导后，YAP过表达细胞和载体细胞的GFP-LC3点显著增加，且YAP过表达细胞的GFP-LC3点多于载体细胞。此外，CQ治疗消除了载体和YAP过表达细胞之间的自噬通量差异（图2c和d）。与我们的活体成像结果一致，透射电镜结果显示YAP过表达细胞含有更多的自噬小泡（图2e&f）。雷帕霉素处理后，YAP过表达细胞中的APs和ALs均增加，ALs的增加高于APs（图2g），表明YAP促进诱导自噬体的成熟。
为了进一步阐明YAP调控自噬体成熟，我们将pEGFP-RFP-LC3质粒瞬时转染YAP过表达的U251细胞，在ND诱导后用共聚焦显微镜观察APs和ALs的图像。GFP信号对pH敏感，在酸性自溶体中猝灭，而RFP则更稳定，因此，GFP和RFP荧光的共定位表明AP没有与溶酶体融合；而没有GFP的RFP信号对应于AL。经ND处理2小时后，YAP过表达的U251细胞显示出的APs数量比载体细胞的数量略少，而ALs显著增加（图2h，i），这表明YAP通过加速AP表达的过程促进自噬体成熟与溶酶体融合形成铝。在雷帕霉素或饥饿诱导的条件下，YAP共同增强自噬。
图2 YAP在雷帕霉素或饥饿诱导的条件下增强自噬
(a)在载体和YAP过表达的U251细胞中有或没有Rap或Rap加CQ处理的LC3和p62水平的代表性免疫印迹。(b)转染GFP-LC3 24 h后，在指定时间拍摄载体和YAP过表达细胞的荧光显微照片，并显示有代表性的图像。(c)细胞在正常培养基（未处理）、EBSS（ND）或EBSS+CQ（ND+CQ）中培养2 h。表达GFP-LC3的载体和YAP细胞的代表性荧光显微照片。(d)U251细胞中GFP-LC3点状物的定量如（c）所示。(e)经Rap处理的载体和YAP过表达U251细胞的代表性电子显微照片。白色箭头表示AP；蓝色箭头表示AL。（e）中显示的U251细胞的总AVs（f）、AP和AL（g）的定量。h转染pEGFP-RFPLC3 24 h后，在EBSS中培养2 h，载体和YAP过表达U251细胞的典型共聚焦荧光显微照片，U251细胞定量结果（h）。
3. 自噬是YAP促进胶质瘤进展的关键
由于YAP促进胶质瘤进展和细胞自噬，我们想知道YAP对胶质瘤进展的促进作用是否由自噬介导。如图3a&b所示，我们通过EdU掺入法检测，自噬抑制剂CQ不仅能显著抑制U251胶质瘤细胞的增殖，而且能消除YAP对胶质瘤细胞增殖的促进作用。通过CCK8测定，我们获得了类似的结果（图3c）。
此外，我们在颅内胶质瘤模型中进行了上述实验，将载体控制或YAP过表达的U87 GFP-luci细胞注射到裸鼠右侧纹状体，结合或不结合CQ（25 mg/kg，每隔一天）治疗（图3d）。我们每7天用生物发光值监测肿瘤生长，生物发光成像分析表明，YAP过表达细胞的肿瘤明显大于载体小鼠。重要的是，CQ可以抑制YAP过表达的生长优势（图3e-3h）；此外，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，注射YAP过表达细胞的小鼠在CQ治疗后的中位生存时间延长，表明CQ治疗的小鼠具有生存优势（图3i）。CQ治疗组的增殖标志物Ki67阳性细胞数持续显著减少（图3j&k）。
图3 自噬是YAP促进胶质瘤进展的关键
(a)EdU分析载体和YAP过表达U251细胞中用或不用CQ处理14 h的细胞增殖。用DAPI（蓝色）染色细胞核，EdU（红色）显示合并的细胞。(b)定量分析EdU阳性细胞。(c)用CCK-8法检测CQ对载体和YAP过表达细胞增殖的影响。(d)活体实验工作流程的三维示意图。(e)植入小鼠后各组的代表性彩色生物发光图像。(f)光子通量的定量分析。(g&h)来源于载体和YAP过表达的U87细胞的HE染色的代表性图像（g）和肿瘤体积的定量分析（h）。(i)用Kaplan-Meier生存曲线测定总生存率，用对数秩检验评价差异的统计学意义（n=8）。(j&k)来自载体和YAP过表达细胞的肿瘤的Ki67染色的代表性图像（经或未经CQ治疗）（j）和Ki67阳性细胞的定量分析（k）。
4. YAP上调HMGB1并促进其从核向细胞质转移
为了探讨YAP促进胶质瘤自噬的分子机制，我们利用iTraq蛋白质组学方法筛选了可能介导YAP促进胶质瘤自噬的蛋白。根据蛋白质组学策略，从YAP过表达和对照比较中确定了21个蛋白质，同时满足以下两个标准：1）p<0.05（Mann-Whitney检验）；2）属于KEGG动物自噬途径，热图显示了两组间21种差异表达蛋白的相对水平（图4a）。根据文献，在这些蛋白质中，HMGB1是最吸引人的一种。因此，我们首先检测了YAP过表达后HMGB1的蛋白质和mRNA水平，发现YAP过表达后HMGB1的蛋白质和mRNA水平均增加（图4b-c）。此外，由于泛素-蛋白酶体系统和自噬是真核细胞内两条主要的降解途径，我们进一步想知道YAP是否通过调节这两条途径上调HMGB1蛋白水平。我们发现在YAP过度表达后，HMGB1蛋白水平在MG132（蛋白体抑制剂，sFig.1A,1B）或与氯喹（自噬抑制剂，sFig.1C,1D）处理中也没有改变，表明YAP不是通过翻译后途径上调HMGB1。与上述结果一致，YAP和HMGB1在胶质瘤组织中的表达上调（图4d&e，sFig.2），且两者呈正相关（图4f，p<0.001，r=0.6938）。有趣的是，在YAP过表达小鼠的异种移植中，HMGB1和LC3-II的蛋白质水平增加（图4g）。重要的是，HMGB1主要存在于细胞核中，而在YAP过度表达后，其在细胞质中的水平增加（图4h&i）。综上所述，YAP上调HMGB1表达，促进HMGB1从细胞核向细胞质的转运，促进自噬。
图4 YAP上调HMGB1并促进其从细胞核到细胞质的易位
(a)热图显示在U87胶质瘤细胞中YAP过表达后，上调或下调的蛋白与自噬有关。(b)用抗YAP和抗HMGB1抗体探测载体和YAP过表达U87和U251细胞提取物的代表性免疫印迹。(c) YAP在U251和U87胶质瘤细胞中高表达后，HMGB1的mRNA水平。(d)从非肿瘤组织（n=9）或不同级别胶质瘤组织（n=27）中提取的总裂解物的代表性免疫印迹。(e)脑胶质瘤中YAP和HMGB1蛋白水平的定量分析。(f)脑胶质瘤中YAP与HMGB1蛋白水平呈正相关。r=0.6938，p<0.0001，n=36。(g)用指定抗体检测未经CQ处理的来自载体和YAP过表达细胞的肿瘤提取物的代表性免疫印迹。(h)用细胞分离法检测HMGB1的亚细胞定位，组蛋白和GAPDH分别作为细胞核和细胞质的负荷控制。(i)免疫荧光法检测HMGB1的亚细胞定位。
5. HMGB1介导YAP对胶质瘤自噬和生长的促进作用
为了检测HMGB1是否是YAP在自噬中的介导者，我们用三种shHMGB1下调HMGB1（sFig.3A），发现HMGB1下调后LC3-II蛋白水平下降（图5a）。一直以来，YAP对LC3-II的影响被HMGB1下调所消除（图5b和c）；此外，敲除HMGB1可抑制YAP过表达诱导的GFP-LC3点（mCherry暗示HMGB1下调细胞，图5d&e）、AVs、APs和ALs的增加（图5f-i），表明HMGB1介导YAP对自噬的促进作用。
接下来我们研究了YAP对胶质瘤生长的促进作用是否由HMGB1介导。如图6a和图b所示，我们通过EdU掺入试验检测，HMGB1的下调显著抑制U251胶质瘤细胞的活力，并且也消除了YAP的促进作用，我们使用CCK8试验获得了类似的结果（图6c）。接下来，我们将具有或不具有HMGB1下调的YAP过表达的U87 GFP-Luci细胞注射到裸鼠的右纹状体中以建立颅内胶质瘤，并且每7天使用生物发光值监测肿瘤生长（图6d）。生物发光成像分析显示HMGB1下调显著抑制YAP对肿瘤生长的促进作用（图6e&f）。同样，与YAP过表达组相比，shHMGB1和YAP共表达异种移植物的小鼠的中位生存时间也延长（图6g）。以上结果表明，YAP对胶质瘤生长的促进作用是由HMGB1介导的，与体外实验结果一致。
图5 亚磷酸对自噬的促进作用由HMGB1介导
(a)用指示抗体检测HMGB1下调后U87细胞提取物的典型免疫印迹。(b&c)用所示抗体检测YAP过度表达U87（b）或U251（c）细胞中存在或不存在HMGB1下调的提取物的代表性免疫印迹。(d&e)将GFP-LC3转染U251胶质瘤细胞后，取mCherry-shHMGB1感染或无mCherry-shHMGB1感染的YAP过度表达细胞的荧光显微图像（d）进行定量分析（e）。(f)在HMGB1下调或不下调的情况下，表达YAP和载体的U251细胞的代表性电子显微图。白色箭头表示AP；蓝色箭头表示AL。(g&h) U251细胞总AVs（g）、AP（h）和AL（i）的定量。
图6 HMGB1介导YAP对胶质瘤生长的促进作用
(a)一种有或没有HMGB1下调的载体和YAP过表达细胞EdU分析的代表性图像。(b)来自（a）的定量结果。(c)用CCK-8法检测HMGB1敲除对细胞增殖的影响，并用YAP过表达细胞检测HMGB1敲除对细胞增殖的影响。（d）体内实验流程示意图。（e）植入小鼠后各组的代表性彩色生物发光图像。（f）光子通量的定量分析。（g）总生存率由Kaplan-Meier生存曲线确定，并用对数秩检验评价差异的统计意义（n≥7）。
6. YAP与HMGB1的相关表达与临床GBM的预后有关
为了了解YAP和HMGB1在胶质瘤标本中的临床意义，我们首先分析了TCGA和CGGA数据库。界定高表达或低表达的临界值为中值。随访期间，YAP低表达组的总生存时间明显长于YAP高表达组(sFig. 4A，CGGA: YAP high, n= 334; YAP low, n = 334; p < 0.0001; sFig. 4B, TCGA: YAP high, n = 351; YAPlow，n = 351; p <0.0001)。此外，在高级别胶质瘤数据库中，HMGB1的mRNA水平也与预后不良密切相关(sFig. 4C，CGGA: HMGB1 high,n = 244; HMGB1 low, n = 244; p = 0.0441)。
接下来，通过western blotting检测，我们发现YAP和HMGB1、YAP和LC3-II在高级别胶质瘤样本中的表达呈正相关，与CGGA数据库分析一致（图7a-c）。为了进一步阐明YAP和HMGB1对GBM生物学行为的重要性，我们通过免疫组织化学染色（图7d）分析了它们在51例高级别胶质瘤标本中的表达，发现YAP和HMGB1表达之间存在正相关（图7e，h），与上述结果一致。根据高级别胶质瘤患者的随访资料（n=39），这些发现的临床意义通过确定患者的生存时间与YAP和HMGB1染色呈负相关而突出（图7f-h）。最有趣的是，YAP和HMGB1均高的患者预后较差（图7h）。
图7 YAP和HMGB1的相关表达与临床GBM预后有关
（a）高等样品中提取的总裂解物的代表性免疫印迹。（b&c）脑胶质瘤中YAP蛋白水平与HMGB1、LC3-II呈正相关。（d）临床GBM标本中YAP和HMGB1的IHC染色的代表性图像。（e） IHC检测胶质瘤中YAP蛋白水平与HMGB1呈正相关。（f-h） YAP（f）或HMGB1（g）高或低水平或YAP和HMGB1均高或低表达（h）的GBM患者的Kaplan-Meier分析。YAP高或低表达与HMGB1水平相关的IHC数据（h）。（i）工作模式：YAP通过促进HMGB1从细胞核到细胞质的转录和易位，从而促进胶质瘤自噬和进展。
讨论
许多研究提供了令人信服的证据，恶性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤类型，中位生存期不超过15个月；脑胶质瘤的进展与缺氧饥饿条件下的细胞自噬密切相关。在本篇文章中，我们证明YAP促进胶质瘤自噬，然后在体外和体内进展。在机制上，YAP通过促进HMGB1从细胞核到细胞质的转录和易位，导致自噬来实现上述作用（图7i）。YAP与HMGB1的表达呈正相关，暗示临床GBM预后不良。总之，我们的数据描述了一个介导YAP促进GBM自噬活性和致瘤性的YAP-HMGB1信号轴，并为制定替代策略提供了基础，例如YAP高GBM患者的自噬抑制剂联合治疗。
Hippo/YAP通路最初被认为是器官大小的中枢发育调节器，在许多类型的人类肿瘤中被发现受到干扰。YAP位于信号中枢的中心，从物理环境中获取信息并将其转化为转录反应，因此参与许多细胞过程，如肿瘤生长、生存、转移、干细胞、耐药性和自噬。据报道，YAP通过增强自噬通量来保护ND条件下的MCF7细胞免受凋亡。在这项研究中，我们发现YAP不仅在基础条件下促进胶质瘤自噬，而且在应激诱导的条件下也促进胶质瘤自噬。最近我们使用自噬抑制剂CQ或HCQ与其他药物或治疗方法联合进行的GBM I/II期临床试验显示了一些令人鼓舞的结果。我们发现CQ对自噬的抑制部分消除了YAP对胶质瘤进展的促进作用，表明YAP高胶质瘤的发生部分依赖于YAP驱动的自噬。然而，至于为什么CQ治疗的存活益处小于对生长抑制的作用，我们目前没有很好的解释。我们推测这可能与CQ的使用剂量和一些未知的原因有关。我们的研究提高了YAP与GBM和自噬的关系的认识。
由于YAP是一种著名的共转录因子，其自噬分子机制的研究主要集中在其转录作用上，例如，Song等人报道YAP对自噬的调节依赖于促生长转录因子的TEAD家族。最近的研究表明，YAP通过促进肌球蛋白II家族基因和Armus的转录来调节乳腺癌细胞的自噬。在本研究中，我们通过基于iTraq的蛋白质组学分析和系统实验，确定HMGB1是YAP自噬的介导者。HMGB1以前与诱导自噬有关，被认为是在癌症治疗中利用HMGB1诱导的自噬的潜力。值得注意的是，Zhang等人发现HMGB1-TLR2通过调节Hippo/YAP途径诱导CD133-癌细胞脱分化；Chen等人还发现HMGB1通过依赖性有氧糖酵解来控制肝癌的发生。以上研究表明HMGB1对YAP活性有调节作用。在本篇文章中，我们报道了YAP通过促进HMGB1的转录而不是通过影响其翻译后修饰来上调HMGB1；此外，YAP促进HMGB1从细胞核到细胞质的易位，导致自噬。这些结果强调了YAP-HMGB1通路是YAP诱导GBM细胞自噬的关键介质。此外，尽管Su等人报道了Lewis细胞营养缺失后HMGB1的增加，但我们还没有发现U251细胞暴露在自噬条件下HMGB1的增加。Tang等人和Thorburn等人也没有发现自噬诱导后MEF和U87细胞中总细胞裂解物中HMGB1的增加，这与我们的结果一致。我们发现两组在H2O2或HBSS诱导后， HMGB1均从细胞核向细胞外或胞质移位，我们推测这种差异可能是由于使用不同的细胞系和不同的自噬诱导方式所致。
自噬的关键功能是在饥饿条件下提供能量和代谢前体，并通过去除对细胞生存有害的受损蛋白质和细胞器来减轻压力。因此，在大多数情况下，自噬似乎是一种促进生存的应激反应。一般来说，在已建立的肿瘤中，自噬通过增强应激耐受性和提供更多的营养和能量，在支持肿瘤细胞存活方面发挥重要作用。胶质瘤长期生长在缺氧、低血糖环境中，是研究自噬及其在肿瘤发生发展中作用的良好模型。在我们的系统中，通过使用三组胶质瘤样本，我们发现YAP和HMGB1的表达相互正相关，并且对临床GBM有预后作用，这与我们在体外的结果一致。这些数据表明YAP和HMGB1是治疗GBM等恶性肿瘤的两个可行的治疗靶点。
结论
我们的数据表明，YAP诱导细胞保护性自噬，并通过上调HMGB1促进GBM恶性。由于涉及自噬抑制的临床前研究已经激发了大量针对自噬的临床试验，作为多种癌症联合治疗的一部分，本研究揭示了化疗与药物自噬抑制相结合治疗YAP高表达GBM患者的可能性。这些结果是否可以推广到其他癌症，这将是一个有趣的发现。