科研| PNAS：肾近端小管的遥感和信号传导，刺激肠道菌群来源的有机阴离子分泌
编译：Mendelsohn，编辑：谢衣、江舜尧。
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论文ID
原名：Remote sensing and signaling in kidney proximal tubules stimulates gut microbiome-derived organic anion secretion
译名：肾近端小管的遥感和信号传导，刺激肠道菌群来源的有机阴离子分泌
期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）
影响因子：9.58
发表时间：2019-08-06
通讯作者：Rosalinde Masereeuwa
通讯作者单位：Division of Pharmacology, Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, The Netherlands.
实验设计
实验结果
人类的肠道为复杂的微生物生态系统提供了栖息地，其中微生物的基因数量惊人。微生物组代表着复杂的代谢能力网络，可补充我们的哺乳动物代谢，代谢共生可利用人类代谢无法获得的营养来源。肠道微生物代谢与人类代谢之间存在重要的交互作用。微生物所特有的代谢产物丰富了人体的代谢，从而提供了能量、维生素和营养信号。从进化的角度来看，人类肠道微生物生态系统的共生提供了相互的代谢益处，从而有助于机体适应。
这并不一定意味着每种微生物代谢物都是有益的。相反，大多数微生物代谢物在经历II期代谢后，许多代谢物会从体内主动排出。肾脏可能是最重要的排泄途径，尿液中可以发现大量的微生物代谢产物。这就提出了这样的假设，肾脏排泄能力是人类微生物共生的重要组成部分。它允许肠道吸收多种主要有益的微生物代谢产物，而肾脏则清除了无用或可能有害的代谢产物。这种在器官间通过小分子的通讯被假定为遥感和信号传递。大量来自慢性肾脏病（CKD）患者的证据为肾脏在人类微生物共生中的作用提供了有力的支持。已发现许多微生物来源的代谢产物，包括硫酸吲哚酚（IS）、PCS（PCS）和氧化三甲胺（TMO），会在血液中积聚，与肾功能的丧失相一致，并被证明与CKD患者的临床雨后有关）。“肠肾轴”这一概念于是应运而生。
代谢物的远程感知和信号传导是将环境代谢变化对体内稳态的干扰最小化的一种机制。对于肝脏、肠道和大脑中的葡萄糖、氨基酸和脂质，已形成具有重叠底物的转运蛋白网络的协调作用。膜转运蛋白被认为与代谢物感测有关，并且广泛表达于上皮屏障，包括肾脏近端小管节段。作为肾脏溶质载体22家族成员，有机阴离子转运蛋白（OAT）能够转运各种废物溶质，包括来自消化食品和内源性代谢过程的废物，以及环境化合物和药物，故OTA成为用于遥感的候选物分子。
我们探索了肾脏近端小管是否可以通过感知肠道微生物内源性代谢产物水平升高来调节体内稳态，并且是否通过OAT1（SLC22A6）刺激分泌机制做出反应，对此我们将IS作为典型毒素进行了研究。我们证明肾脏中存在由表皮生长因子受体（EGFR）和OAT1作为IS传感器控制的代谢物传感和信号传导，以及芳烃受体（AhR）-ARNT复合物和下游EGFR MAPK-ERK的相互作用，并伴有miR-223和活性氧（ROS）信号传导。我们在这里描述了肾小管感知代谢物水平升高并通过激活促进代谢物分泌的途径作出反应的能力。肾脏对肠道菌群衍生的代谢产物进行遥感和信号传递的能力进一步支持了“肠-肾轴”学说。
1.肾脏感知并传导肠源性代谢物升高的信号，并促进肾脏分泌
我们先前研究了高蛋白饮食对色氨酸和酚代谢物的影响。健康志愿者接受高蛋白饮食14天（图1A），血浆IS水平升高，尿IS排泄增加45±14%（图1B，P<0.01）。浓度依赖性增加转运蛋白介导的尿排泄并不少见，只要血清浓度低于转运最大值。然而，我们质疑IS的排泄途径是否能被感知和调节以平衡血清浓度。在这项探索性研究中，我们观察到从尿液中分离的肾近曲小管上皮细胞中OAT1信使RNA（mRNA）表达增加了70%，尽管这种增加并不显著（图1C）。正如我们小组和其他人研究所显示的，尿上皮细胞是具有类似于人类肾组织中肾上皮细胞的近端小管特征的活细胞，故尿液是我们研究队列中OAT1表达的理想来源。为了进一步探索IS的排泄途径是否可以被感知和调节，第二个研究中我们分析了36名正常健康志愿者摄入从玉米、乳清和牛血浆中所提取蛋白质浓缩物后的数据（图1D）。色氨酸和酪氨酸是IS和PCS的前体，预计在动物源性饲料中最为丰富。的确，与玉米和乳清蛋白相比，牛源性蛋白摄入后，尿中IS和PCS的排泄量增加（图1e和F），尽管与IS相比，PCS的增加程度较小。
为检测IS本身是否调节OAT1的表达，我们使用一个腺嘌呤CKD大鼠模型，用IS灌胃（图1G）。与对照组相比，IS治疗7周后肾IS清除率增加（IS组4.4±0.7 mL/min vs.对照组0.1±0.02 mL min/1；图1H），从尿肾上皮细胞分离的OAT1 mRNA表达增加2.7±0.6倍（图1I，P<0.05）。同样，CKD大鼠灌胃PCS，检测代谢物传感和信号特异性。两种代谢物，PCS和IS的清除率在给药5周后与第1周相比有所下降。在PCS组中，OAT1蛋白的表达降低了40%以上，而在IS组中，表达水平保持不变。总之，IS介导的OAT1分泌途径的诱导提示了具有活性和特异性的代谢物感知和传导信号机制参与其中。
图1：人和大鼠对肠源性代谢物血浆水平升高的感知及信号传导，并促进代谢物的排泄。（A）人体研究设计示意图。（B）在高蛋白饮食干预前后硫酸吲哚酚的排泄。（C） 高蛋白饮食干预前后人体肾脏细胞OAT1的表达。（D） 第二个人类研究（n=36名志愿者）的流程示意图，采用从玉米、乳清和牛血浆中随机抽取的蛋白质浓缩物。（E） 在玉米、乳清和牛血浆蛋白浓缩物干预后，硫酸吲哚酚和硫酸对甲酚的排泄。（G） 动物实验设计示意图。（H） 随着时间的推移，在对照组（三角形）和IS干预组（正方形）的慢性肾病大鼠中，硫酸吲哚酚的清除率。（I）空白对照组（三角形）和IS（正方形）干预的大鼠肾细胞中OAT1的表达。
2. IS通过AhR和EGFR轴诱导OAT1的表达和功能
为确定IS介导的OAT1诱导机制，我们研究了AhR-ARNT复合物、EGFR途径及相关分子的参与。已经证明IS诱导了AhR（一种配体依赖的转录因子）的表达。反过来，AhR诱导ATP结合家族膜转运蛋白的表达。事实上，我们观察到膳食蛋白质衍生代谢物激活了AhR，IS似乎是最有效的配体。暴露于临床相关的IS浓度（图2A）的人原代肾上皮细胞或成熟的永生化人近端小管上皮细胞（ciPTEC）导致OAT1表达的明显增加，这个效应可被AhR拮抗剂抑制（图2B-D）。除了激活AhR转录因子外，它还与EGFR的胞外结构域结合，而EGFR也是一种参与OAT1调节的受体。事实上，单克隆抗体西妥昔单抗对EGFR的抑制削弱了IS诱导的OAT1表达，从而证实了EGFR在感知和信号传导中的作用（图2D），对阻断转运体介导的IS在细胞内的积蓄敏感，而EGF的存在对刺激IS诱导的OAT1转运活性至关重要（图2F）。总之，我们的数据表明IS通过EGFR感受器和AhR信号激活OAT1的表达和运输。
EGFR刺激导致下游MAPK和NF-κB信号通路的激活，使用MAPK和NF-κB抑制剂后mRNA的表达（图2G）和功能转运水平下降（图2H和I）。当EGFR信号被西妥昔单抗抑制时，ARNT的核表达减弱（图2J和K），ARNT是AhR在细胞摄取后与之结合形成ARNT-RhR复合物。这证实了EGFR和AhR在IS感知和信号传导中的相互作用。此外，microRNA-223（miR-223）被报道是与AhR和EGFR信号转导相关的基因，可能在肾脏感知和信号转导假说中发挥关键作用。miR-223确实参与了肾脏感知及信号传导的调节，因为抑制miR-233可降低OAT1活性（图2L）并减少ARNT核表达（图2M）。同时，miR-223本身的表达在处理过的细胞中没有改变，清除miR223也没有影响MAPK1、BRAF（EGF信号）或AhR和AhR阻遏基因的表达。这些数据表明，在代谢传感和信号适应过程中，多种信号通路之间的相互关系是OAT1调节的关键。
图2：在miR-223的调控下，IS通过AhR和EGFR轴在体外诱导OAT1的表达和功能。（A） 肾近曲小管细胞体外实验设计示意图。（B） 对照组和IS干预的ciPTEC细胞中，在有或无α-萘酚（aNF）情况下OAT1基因表达情况。（C）在原代肾脏细胞予IS干预后OAT1基因表达情况。（D）空白对照组和IS干预组分别有或无CH-223191（CH）和西妥昔单抗（CTX）治疗，OAT1蛋白表达情况。（E） 在有或无CH和CTX的情况下，用荧光素转运检测对照组和IS干预组细OAT1的活性。（F） 在有或无表皮生长因子的情况下，荧光素在对照组和IS干预组细胞中的转运。（G）与对照组相比，IS干预细胞中EGF信号的mRNA表达。（H） 在有或无双吲哚甲酰亚胺（BIM；蛋白激酶C抑制剂）、MEK（U-0126；MEK抑制剂）和LY-294002（LY；磷酸肌醇3激酶抑制剂）的情况下，荧光素在对照组和IS干预组细胞中的转运情况。（I） 在有或无三氟乙酸盐（SN50；NF-κB抑制剂）的情况下，荧光素在对照组和IS干预组细胞中的转运情况。（J和K）在有或无CTX的对照组和IS干预组细胞中ARNT表达。（M） 在有或无Scr-miR223/a-miR223的情况下，对照组和IS干预组细胞中ARNT的表达。
我们最近建立的一个3D生理性肾脏模型，将细胞植入中空纤维支架使肾上皮细胞层极化（图3A）。使用该模型，我们能够证明经IS干预后经上皮细胞分泌IS增多（35%±13；图3B）。这是诱导OAT1功能的净效应（图2E），伴随着外排转运蛋白乳腺癌耐药蛋白和多重耐药蛋白4的表达增加，两者都参与IS的管腔分泌并受EGFR信号调节。
图3 在三维肾脏模型中IS干预改善经皮肾转运。（A） 三维生物工程肾小管经上皮转运的实验设计。（B） 在对照组和IS干预生物工程肾小管组的IS清除率。
3. 活性氧是遥感和信号传递的驱动力，可通过谷胱甘肽代谢有效解毒
AhR的活化及其核移位与细胞应激和ROS的产生有关。我们证实ROS是由IS诱导产生（图4A），此外，我们还表明ROS是刺激OAT1功能的重要信使，因为抗氧化剂使用抗氧化剂Trolox或乙酰半胱氨酸使ROS猝灭，抵消了IS诱导的转运效应（图4B）。代谢组学分析进一步探讨IS刺激肾上皮细胞后细胞内代谢的变化，揭示了谷胱甘肽和β-丙氨酸代谢的变化（图5）。谷胱甘肽是一种重要的抗氧化剂，对保护细胞免受氧化应激至关重要。还原性谷胱甘肽与氧化性谷胱甘肽的比值是衡量氧化应激的一个很好的指标，在既往研究中经IS处理的内皮细胞中也发现该比值是降低的。与这些发现相一致，IS干预后的肾上皮细胞也显示出还原性谷胱甘肽与氧化性谷胱甘肽的比值下降（比率为0.8±0.05，P=0.03），进一步证实IS诱导这些细胞发生氧化应激（图5A）。此外，β-丙氨酸代谢是细胞耗氧量增加的一个指标，其在IS处理细胞中的下降水平是氧化应激的另一个指标（图5）。总之，遥感和信号传导过程中的细胞应激反应受到严格调控，ROS分子调控OAT1介导的转运。
图4 活性氧有助于遥感和信号传递。（A） 在有或无抗氧化剂trolox和氧化剂H2O2的情况下，对照细胞和IS干预细胞中活性氧的产生。（B） 在有或无N-乙酰-l-半胱氨酸（AcCyst）和trolox情况下，荧光素在对照组和IS干预组细胞中的转运。
图5：IS对氧化应激的感知和信号传导中，诱导谷胱甘肽代谢，抑制β-丙氨酸代谢。（A） IS干预细胞组与对照细胞组的代谢组学分析，绘制了谷胱甘肽代谢、TCA循环、尿素循环、氧化戊糖磷酸途径（PPP）和糖苷的相对代谢产物丰度图。（B） 基于impact和P值的通路分析表明，与对照组相比，IS干预组细胞谷胱甘肽代谢增强，β-丙氨酸减少。
讨论
已有假设肾功能是人体肠道菌群共生的重要组成部分。肾脏对不可用（潜在有害的）微生物代谢物的排泄能力是其他器官无法比拟的。在这里，我们阐述了通过受体介导的信号传导识别人类肾脏感知IS水平升高的有效机制，并通过OAT1诱导其分泌途径作出反应。这种遥感代谢物和信号传递的生物反应受OAT1、EGFR、AhR和miR-223之间复杂的相互作用所控制，这些相互作用诱导ARNT易位和ROS相关的信号转导。总之，该调节途径揭示了肾脏上皮细胞促进的解毒机制，以清除肠源性代谢物和维持体内平衡。
如上所示，在肾上皮细胞ARNT核移位中，IS和下游MAPK-ERK信号通路激活EGFR起着关键作用。我们的结果得到了Tan等研究发现的支持，他们研究表明MAPK-ERK信号被AhR配体二恶英激活，并且这种激活增强了小鼠肝癌细胞中AhR-ARNT异二聚体的转录活性。此外，EGF的补充刺激了AhR-ARNT复合物在人鳞状细胞癌细胞环氧化酶-2基因启动子区域内的结合，分子对接研究表明IS与EGFR的胞外结构域结合，以及表明西妥昔单抗处理的肾上皮细胞通过PI3K-AKT和MAPKK-ERK对EGFR依赖性调节的OAT1进行信号传导。
我们提供了直接的证据，IS激活EGFR和下游MAPK信号，刺激AhR-ARNT核移位，导致肾脏OAT1表达和功能增强。同时，我们研究了miR-223和ROS等相关信号因子。迄今为止，已有超过200个miR-223的靶点被研究，强调其普遍参与细胞过程。清除miR-223导致ARNT易位减少，强调miR-223是ARNT蛋白表达的阳性转录后调节因子。Ogando等人在巨噬细胞中也检测到miR-223与ARNT之间的联系，但他们确认miR-223是一个负性的ARNT调节因子。在我们的研究中，miR-223可能控制与AhR-ARNT复合物相关的阻遏物；然而，准确的靶点识别需要进一步的研究。
氧化和抗氧化之间的平衡对于许多生物过程是必不可少的。已有文献证明，is可诱导多种细胞类型的细胞应激、ROS产生和炎症发生，包括内皮细胞、肌肉细胞、心肌细胞和肾上皮细胞。另一方面，ROS可以作为AhR、EGFR和NF-κB信号传导等关键生理途径的第二信使，提示ROS在代谢物传感的信号转导中起辅助作用。我们的代谢组学分析显示了IS治疗后明显的细胞应激反应，类似于之前的骨骼肌细胞研究。有趣的是，ROS的产生是代谢感知和信号传导的驱动力之一，ROS的清除抵消了IS诱导功能性OAT1的上调。因此，肾上皮细胞的抗氧化反应途径和活性氧水平强调了肾上皮内小分子通讯的重要性和复杂性。
我们的工作符合Nigam及其同事所提出的“遥感和信号假说”，即溶质载体家族介导脏器间甚至生物体间通信中。这些转运蛋白具有广泛的底物特异性，普遍表达在具有屏障功能的组织和器官中。该网络通过相应地调节这些药物转运体的表达和功能来调节重要代谢物和信号分子跨器官的转运（例如，肠-肝-肾轴）。在这里，我们证明了微生物代谢物吲哚在肝脏中被氧化并与硫酸盐结合成为IS，作为一种信号分子，刺激参与肾脏排泄的摄取和外排转运蛋白的表达和功能。在肾脏中，AhR介导的解毒机制在促进内源性和外源性以及环境污染物的清除方面发挥着中心作用。例如，二恶英结合的AhR大量上调细胞色素P450s（CYP）酶。因此，CYPs对二恶英有良好的代谢作用，并能有效地清除体内的二恶英，强调可以激活多种机制来促进废物清除。总之，遥感和信号协调了肠道代谢产物的有效清除，以帮助体内平衡。
这一传感机制为调节OAT1在肾脏中的功能提供了可能，并可能为损伤后保护肾功能开辟一条新的治疗途径。OATs在其他器官（如肝脏、大脑）也有表达，但OATs1在肾脏中的表达最为丰富，为肾脏特异性靶向提供了机会。作为支持，给予IS处理的CKD大鼠中OAT1的表达保持不变，而给予PCS的CKD大鼠中OAT1的表达降低，IS和PCS的清除率降低。此外，发展以细胞为基础的再生疗法来替代肾功能，如生物人工肾（即由肾上皮细胞促进的废物清除），目前在全世界引起高度兴趣。利用细胞辅助装置中的代谢物传感机制激活OAT1介导的转运将提高这些细胞的转运能力。因此，高校的转运能力将提高废物溶质的清除率，这对成功开发肾脏疾病的细胞治疗方法至关重要。此外，OAT3有助于肾脏排泄IS，尽管在大鼠和人亚型中显示亲和力稍低。这两种溶质转运蛋白都有共同的底物，并通过类似的途径进行调控，但也有了截然不同的调控机制。此外，OAT3被认为通过IS摄取和随后的AhR/NF-κB信号传导介导血管毒性。由于我们使用了唯一表达OAT1的肾细胞，因此在肾脏对微生物组代谢的感知、产物信号传导、肾排泄途径中OAT3的潜在作用超出了我们的目前研究范围，亦尚待研究。
总而言之，我们确定了参与代谢物远程感知和信号传递的分子靶点，这些分子靶点可增强OAT1功能，从而促进肾脏清除废物。AhR、EGF和miR-223之间的相互作用，伴随着氧化还原状态的改变，对这一机制至关重要，并强调肾细胞对调节转运过程的明确调控。这些数据为“肠-肾轴”这一重要理论学说提供了额外的支持。
评论
本研究中通过健康志愿者和大鼠模型证明肾脏中存在对肠道菌群代谢物的感应和信号传递。通过体外实验，人肾近端小管细胞模型中，硫酸吲哚酚通过AhR和EGFR信号刺激有机阴离子（OAT-1）分泌，这些信号由miR-223和活性氧调控。这一遥感功能有助于肾脏对肠道菌群代谢物的感知和应答以促进维持内稳态稳定，实现肠道微生物与肾脏之间的互通有无，是“肠肾轴”学说的又一例证，对于发现新的治疗靶点以保护患者的肾脏功能具有重要的意义。
原文网址：https://doi.org/10.1073/pnas.1821809116