蛋白质组学中蛋白样品的酶解方法——胶内酶解

接下来，我们开始正式详细地介绍蛋白质样品进行超滤管内酶解的方法！目前蛋白质酶解的过程主要分为以下几个步骤：

蛋白样品的酶解方法——胶内酶解，蛋白样品在凝胶电泳后进行针对性的酶解

1.蛋白样品进行凝胶电泳后，用刀片切下胶上目标胶点，置于EP管中。

2.用超纯水洗胶块，然后振荡1 min，放置5-10 min 洗去胶上的杂质。然后倒出液体，再加超纯水重复洗一遍，吸水纸吸去液体。

3. ⑴银染脱色：脱色液配制：30 mmol/L K3Fe(CN)6 : 100 mmol/LNa2S2O3=1:1，用前新鲜配制。（参考配制2 mL：K3Fe(CN)6 ：9.9 mg溶于1ml超纯水中，15.85 mg溶于1 mL超纯水中，1：1混匀）注意事项：每次加10个样，加完脱色液后置白纸上观察，颜色脱去后马上加水100 uL冲洗停止反应， 2分钟内吸出，再加100ul水重复洗两次，直到完全洗掉脱色液颜色（胶变得透明），脱色后加入50%乙腈，放置15 min后，吸出液体。

⑵考染脱色：加入50％乙腈，37℃水浴脱色，约30 min。可以看到胶上染料基本除去，变透明。如胶上颜色残余较深，可将液体吸出，再重复一遍，直至染料脱去，胶块变透明。

4.100%乙腈脱水至胶块变成白色，放置，若胶块没有变白，可将乙腈吸出，再加入100%乙腈脱水一次。

5.加入还原剂：25 mM的NH4HCO3（含10mM DTT），封口，57℃水浴1 h。参考配制：6.2 mg DTT，溶于4 mL 25 mM的NH4HCO3。（如是2-DE胶，直接跳到第8步）

6.从水浴锅取出样品后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同体积的烷基化试剂室温暗处放置30 min.

烷基化试剂：25 mM的NH4HCO3（含55 mM IAA）

参考配制方法（4 mL）：40.69mg IAA溶于4 mL 25 mM的NH4HCO3中

7.去掉烷基化试剂，加入50％乙腈，放置15 min

8.加入50 mM的NH4HCO3震荡后静置吸胀5 min，再吸出。

9.先加50％乙腈脱水一遍，再用100％乙腈脱水至胶块变成白色。

10.每管加入适量的酶液（约2-3 μL），冰上放置30 min，直至胶块吸涨酶液。

酶液配制：2 μg Trypsin加入预冷覆盖液150 μL

覆盖液配制（2 mL）：100％乙腈200 μL，100 mM的NH4HCO 30.5 mL，超纯水1.3 mL

注意事项：酶从冰箱取出后所有操作过程，包括样品加酶后，都要放到冰上。

11.检查酶液吸胀情况，多余的酶液吸走，酶液不够，即胶块中仍有白色，则加入适量酶液。

12.加覆盖液20 uL封口，37℃保温16-18小时。

13.萃取

（1）将样品从37度水浴锅中取出后，超声5 min，10000 g/1 min.

（2）将上清转移到新的200 μL的EP管中。

（3）在剩余胶块中加入萃取液（100%乙腈+2.5%TFA用于SDS胶条，2.5 % TFA，67% CAN用于MALDI，5% Formic Acid 67% ACN用于ESI；90%乙腈+2.5%TFA 用于2D胶），37%保温30 min，超声，合并。

萃取液参考配制3 mL：75 μLTFA、2010 μL 100％乙腈、915 μL超纯水。

（4）超声15 min，间隔5 min，重复超声15 min。水温不超过40度。

（5）10000g/1 min，合并上清。

14.冷冻离心干燥

银染凝胶

考马斯亮蓝染色凝胶

注意事项：

1、每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50 uL/管。

2、每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。开盖子动作尽量轻巧，以免胶块弹出。

以上就是胶内蛋白样品的酶解基本过程，希望对大家能有所帮助，如果大家对此方法有任何疑问或建议，欢迎大家在推文下方留言，同时小编会根据大家的反馈，进行更进一步的说明和补充。最后，祝愿科研道路上的大伙们都能数据多多，文章多多，如果您觉得资源对您有所帮助，请多多转发，以帮助更多需要帮助的人!

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