科研 | 中国科学院：定量蛋白质组学分析揭示了鸢尾属植物马蔺对镉的毒性的复杂调节和代谢反应（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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镉污染(Cd)已成为一个严重的环境问题，鸢尾属植物马蔺对镉具有较强的耐受性和积累能力，在镉污染土壤的植物修复中具有很大的应用潜力；然而，由于缺乏马蔺对镉反应机制的分子信息，限制了科研人员对植物修复效率的提高。在本研究中，我们对马蔺的镉响应进行无标签蛋白组学分析，结果显示在嫩枝和根中分别有163个和196个差异表达蛋白(DEPs)。生物信息学分析表明，在镉作用下反应的DEPs主要参与信号转导、离子转运、氧化还原等，并参与氨基酸合成、木质素合成、甘油脂代谢和谷胱甘肽代谢途径，此外，我们还通过基因表达分析验证了7个DEPs的差异表达。最后，我们发现镉诱导的马蔺甘露糖特异性凝集素(IlMSL)增强了镉敏感性，增加了镉在酵母中的积累。本研究的结果将有助于我们进一步了解马蔺耐镉和积累镉的分子机制，并最终为利用耐镉基因开发镉污染土壤的植物修复策略或限制粮食作物中镉积累提供有价值的资源。
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实验设计
3. 测定过氧化氢含量、可溶性蛋白含量和抗氧化酶活性，然后采用电感耦合等离子体质谱法测定镉浓度。
4. 进行蛋白质提取以进行蛋白质组分析和还原烷基化
5. 将蛋白溶液用100 mmol/L TEAB稀释5倍后，按1:50的质量比加入胰蛋白酶，37℃消化过夜，消化后的肽在StrataX C18柱上脱盐。
实验结果
1. 镉对马蔺生长及生理特性的影响
重金属对植物生物量的影响是评价植物对重金属毒性耐受性的重要指标之一。经过25和50 mg/L 镉治疗6天后，马蔺的茎部和根鲜重均显著低于对照组(图1A, B)，镉对根鲜重和茎鲜重的抑制率均小于50% (w/w)。与对照组相比，镉处理组与对照组的茎干重无显著差异，只有50 mg/L 镉处理的马蔺根干重显著下降(图1C、D)。
为了了解马蔺对镉毒性的生理反应，我们测定了镉处理/不处理马蔺幼苗中H2O2和总可溶性蛋白的含量，以及两种典型的抗氧化酶(SOD和POD)的活性。如图1E、F所示，仅50 mg/L 镉的处理可显著提高马蔺幼苗和根中的H2O2含量，在镉处理下，马蔺幼苗的可溶性蛋白含量显著下降，但根的可溶性蛋白含量没有下降(图1G、H)，镉处理提高了马蔺幼苗和根的SOD活性，在50 mg/L 镉处理下，它们的SOD活性显著提高(图1J、K)，此外，镉处理对马蔺POD活性无明显影响，但25和50 mg/L 镉治疗对马蔺根POD活性有显著刺激作用(图1L、M)。
2. 马蔺幼苗中镉的积累
我们还研究了不同镉处理对马蔺组织中镉积累量随时间的变化。如图2所示，当镉浓度为25 mg/L时，马蔺幼苗根的镉含量在6 h时开始显著增加，而在12 h时嫩枝的镉含量开始显著增加。在50 mg/L 镉处理后，24 h和3 d时，马蔺根和嫩枝的镉积累显著增加，在两种镉浓度下，根和芽中的镉含量沿各时间点持续增加，直到14 d，而经过14天的镉处理，在25 mg/L和50 mg/L 镉下，马蔺幼苗的镉含量分别达到303 mg/kg DW和542 mg/kg DW，均超过了镉超积累器的临界值(100 mg/kg DW)，随着处理时间的延长，镉转运系数增大，但镉转运系数小于1。
3. 镉处理下马蔺蛋白的定性分析
浓度测定和SDS-PAGE结果表明，提取的蛋白质量良好，可以进行后续的定性定量实验。经酶解和脱盐后，我们鉴定出马蔺根的总蛋白，鉴定结果的过滤标准为多肽可靠性≥95%，鉴定出的蛋白至少含有一种独特的多肽。四组样品合并后，我们共鉴定出3199个蛋白组(蛋白合并后)，含有16,991条特定肽序列。
为了分析结果的可靠性，我们测定前体耐受性的分布(肽的理论分子量与测量分子量的差值)如图S2A所示。前驱离子的dmass (Da)基本分布在±0.1 Da以内，说明鉴定结果准确性高，从肽段长度分布来看，我们鉴定出的大部分肽段集中在10-22范围内，与质谱仪鉴定出的分子量范围(400-1200)一致。
4. 蛋白质功能注释
鉴定蛋白的功能由GO (Gene Ontology)进行注释，并利用KEGG(京都基因和基因组百科全书)途径和COG(蛋白质的同源组集群)数据库。如图S3所示，GO数据库注释了最多的蛋白(2853)，在COG和KEGG数据库上分别注释了1,908个蛋白和1,710个蛋白。GO函数注释显示，马蔺蛋白共50个GO项，在生物过程(BP)类别中“代谢过程”所占比例最高(2233,78.27%)；在细胞成分(CC)中，88.26%(2518)的蛋白表达在“细胞”中；在分子功能(MF)类别中，以“催化活性”标注的蛋白数量最多(1634,57.27%) (图S4)。COG是蛋白质同源分类的数据库，马蔺蛋白的COG注释显示，大多数蛋白被指定为“一般功能预测”(图S5)。KEGG注释显示，“代谢途径”蛋白含量最高(844,37.93%)，其次是“次生代谢合成”(472,21.21%)和“不同环境下的微生物代谢”(279,12.54%)(表S3)。由于KEGG基因数据库中植物和微生物的注释信息少于动物和微生物，且缺乏马蔺的基因组信息，因此在KEGG数据库中，马蔺的蛋白可能在微生物代谢途径中注释。总的来说，这些注释信息可以让我们更好地了解马蔺中蛋白质的生物学功能。
5. 差异表达蛋白的鉴定
根据差异表达蛋白(DEPs)的筛选标准(Fold Change≥2，p-value<0.05)，我们分别在镉处理的马蔺幼苗和根中鉴定出163和196个DEPs(图3;表S4, S5)，其中，马蔺幼苗中DEPs表达显著上调81个，DEPs表达下调82个；而镉处理的马蔺根中111和85的DEPs表达分别显著上调和下调；Venn分析显示，5个和2个DEPs在芽和根中分别被上调和下调；层次聚类分析表明，根据整体上对马蔺幼苗和根蛋白表达模式的差异，马蔺蛋白的表达模式可分为五种类型(图S6A)。此外，层次聚类热图还反映了蛋白在各组的三个生物复制样本中具有相似的表达模式。图S6B显示了任意两个样品之间的蛋白质定量值的相关性，任意两个生物重复样品之间有很强的正相关性(Pearson相关系数r > 0.92)表明蛋白质组分析具有较高的重复性。
6. DEPs的GO和KEGG途径富集分析
通过GO和KEGG通路富集分析可以预测DEPs的生物学功能。马蔺幼苗中DEPs的三个最丰富的GO项列于表1：GO注释显示，光合作用相关的“叶绿体”、“氧释放复合物”和“光系统I组装”等GO项在马蔺幼苗中显著富集，说明光合作用可能在马蔺幼苗对镉的反应中发挥重要作用，此外，“木质素生物合成过程”属于三个富集度最高的BP，说明木质素积累可能也参与了马蔺对镉的响应；在马蔺根中，“谷胱甘肽转移酶活性”和“谷胱甘肽代谢”分别是MF和BP本体中显著富集的术语，表明谷胱甘肽可能参与了马蔺根的镉解毒。
通过KEGG途径富集分析，我们发现马蔺根中的DEPs在“赖氨酸生物合成”、“戊糖与葡萄糖酸互转化”、“甘油脂代谢”和“核黄素代谢”中显著富集，表明马蔺根中的初级代谢参与了镉的响应(图4A;表S6)。如图4B所示和表S7，DEPs显著富集在马蔺根的九条生化代谢途径，最丰富的谷胱甘肽代谢通路，与去富集分析的结果一致，表明谷胱甘肽合成代谢可能是马蔺根抵制镉毒性的一个关键途径。
7. 利用MapMan分析DEPs的调控和代谢途径
为了进一步了解镉应答蛋白在马蔺幼苗和根中的作用，我们使用MapMan软件分析了DEPs参与的调控和代谢途径(表S8, S9)，调控途径的可视化如图5A, B所示，许多DEPs与蛋白降解和转录因子相关，此外，在幼苗和根中，镉上调了激素[6-苄基氨基嘌呤(BA)、细胞分裂素(CTK)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)]的信号转导相关蛋白，一些蛋白激酶和G蛋白在镉处理的马蔺根中也有上调。图5C、D显示DEPs分布在不同的一级和二级代谢途径中，大多数DEPs参与马蔺幼苗中的氨基酸、细胞壁和次生代谢(萜类、黄酮类、苯丙类和酚类物质代谢)途径，而DEPs在马蔺根中主要参与脂类、细胞壁、苯丙类和酚类物质代谢途径。
8.基因编码DEPs的表达分析
基于马蔺幼苗和根中DEPs的生物功能注释和富集分析，我们筛选了七个重要镉调节DEPs进行基因表达分析，包括ABC转运蛋白(IlABCC和IlABCG)、木质素生物合成的酶(桂皮酰辅酶A还原酶(IlCCR)咖啡酰基辅酶A-O-甲基转移酶 (IlCCoAOMT)]、JA生物合成相关酶(12-氧化酸还原酶(IlOPR))、谷胱甘肽转移酶(IlGST)和甘露糖特异性凝集素(IlMSL)(表S10)。如图6所示，与镉处理对照组相比，马蔺根中IlABCC、IlABCG、IlCCR和IlOPR编码基因表达水平显著上调，IlABCG和IlOPR基因表达趋势与蛋白相似；在马蔺根中，镉上调蛋白编码基因IlCCR、IlOPR、IlGST和IlMSL的表达水平在镉暴露下显著升高。总的来说，基因和蛋白质的表达趋势是相似的，这验证了我们的发现。
9.酵母IlMSL蛋白功能分析
在以上选择的DEPs中，镉处理下马蔺根中IlMSL的蛋白质丰度增幅最大(124.03倍)(表S10)；同样，在不同镉浓度下，马蔺根中IlMSL基因表达显著上调(图6)，因此，我们选择IlMSL作为候选蛋白，进一步研究其在异种系统中对镉耐受和积累的作用。为了验证IlMSL蛋白在镉耐受和积累中的作用，我们克隆了IlMSL基因全长编码序列(GenBank登录号:MN871823)，转移酵母表达载体(pYES2-IlMSL)转入酵母镉敏感突变体ycf1，分析了表达IlMSL的酵母对镉的耐受和积累特性(图7)。结果表明，在正常培养基上表达IlMSL的酵母与空白载体(pYES2)对照的酵母生长表型没有差异，但在含镉的培养基上，添加IlMSL的酵母菌生长程度与对照相比显著降低，且随着镉浓度的增加抑制生长的程度增强，此外，表达IlMSL的酵母对镉的积累量高于空白载体。这些结果表明，IlMSL在酵母中对镉的耐受和积累起重要作用。
讨论
随着工农业的快速发展，矿山荒地和废渣的生产增加了镉的污染，这是一个严重的问题，受到了广泛的关注。植物修复是一种环保且具有成本效益的可持续“绿色清洁”技术，具有清除被镉污染的土壤的潜力;此外，镉污染土壤的植物修复效率与植物的生物量，镉耐受性和积累能力密切相关。
植物的生长受到镉毒性的影响。在本篇研究中，我们发现马蔺对镉具有耐受性，与对照相比，马蔺幼苗在25和50 mg / L 镉处理后的干重没有显着下降，而2和5 mg / L 镉在水耕条件下显着降低了水稻幼苗的干重。有研究者观察到镉蓄积物的干重明显被80和120μmol/ L Cd（9和13.5 mg / L Cd）降低了，这些结果表明马蔺具有很强的镉耐受能力。 SOD和POD是清除过量的过氧化物（O2·-）和H2O2的两种关键酶，它们可能在重金属毒性下引起植物细胞的氧化损伤。在本研究中，镉处理均刺激了马蔺幼苗中SOD和POD的活性，表明SOD和POD调节的抗氧化防御系统可能在马蔺对镉毒性的响应和耐受中起重要作用。最近的研究表明，SOD和POD也参与了其他一些镉超富集物/累积物对镉胁迫的耐受；另外，先前的研究报道花生具有更高的在营养器官中积累镉的能力，研究者用200μmol/ L Cd（约23 mg / L Cd）处理花生两周后，花生叶片中镉含量约为120 mg / kg，占花生叶中镉的40%；而25天的25 mg / L Cd处理后，马蔺中的镉含量增加。我们的结果表明，马蔺对镉具有很高的蓄积能力。
在镉胁迫过程中，植物主要利用两种途径。首先是外部排斥机制，即避免过量的镉吸收到植物细胞中，或阻止镉在植物中的运输，其中，第二种方法是内部耐受机制，而镉以非生物活性的结合形式存在于植物中，例如与GSH和PCs螯合剂结合，主动转运入液泡或与某些有机酸和蛋白质结合。为了了解马蔺对镉的分子耐受机理，我们在马蔺幼苗中通过无标记定量方法进行了详尽的蛋白质组学分析，鉴定出的DEPs将提供关于马蔺对镉暴露的蛋白质组反应的有价值的信息。
1.木质素代谢蛋白在马蔺镉反应中的作用
对于大多数植物来说，植物吸收的镉主要保留在根系中，在茎部组织中积累有限，根细胞壁是镉离子跨膜运输进入细胞质的第一道屏障。细胞壁中木质素的生物合成可以改变细胞壁结合重金属离子的能力，调节植物对重金属的耐受、转运和积累过程。有研究者发现甜高粱中镉运输能力强的菌株H18通过共生途径吸收的镉含量显著高于镉运输能力弱的菌株L69。两系间差异表达基因和镉响应基因主要集中在苯丙烷和木质素的合成以及细胞壁修饰的过程中，说明木质素屏障可能是甜高粱对镉吸收和转运能力差异的原因。其他研究表明硒(Se)可通过调控水稻木质素合成相关基因的表达，降低木质素含量和细胞壁厚度，降低镉对水稻悬浮细胞的毒害作用。植物中木质素合成相关基因的过表达增加了木质素在细胞壁中的积累，减少了根细胞质中重金属的积累，增强了植物对重金属的耐受性。肉桂酰辅酶a还原酶(Cinnamoyl-CoAreductase, CCR)是木质素特异性生物合成途径的第一个关键酶，它可能对木质素生物合成途径的碳通量有潜在的调节作用，在木质素单体的生物合成中起着关键作用。在我们的研究中,我们发现一个CCR(comp326548_c0_seq1_2)蛋白的表达水平在镉处理了马蔺根时(表2)明显上调了,也有研究者通过对两个Cd积累差异花生品种的比较蛋白质组学分析发现, CCR蛋白可能通过参与木质素的生物合成来参与花生镉积累中的作用。咖啡酰辅酶A甲基转移酶(CCoAMT)是另一种参与两种木质素单体(sinapyl alcohol和coniferyl alcohol)生物合成的关键酶。最近的研究发现，Vicia sativaVsCCoAOMT的异位表达通过将镉固定在细胞壁上增强了拟南芥的镉耐性。在镉胁迫下，我们发现两个CCoAMT(comp334016_c0_seq2_2和comp276910_c0_seq2_2)蛋白分别在芽和根中表达上调(表2)，表明木质素单体生物合成途径可能马蔺幼苗对镉的应答中起重要作用。
表2 参与马蔺幼苗关键调控和代谢过程的Cd调控蛋白列表
2.马蔺中ABC转运蛋白在镉应答中的作用
金属离子的积累主要是由细胞外吸收、细胞内金属结合和细胞分隔所决定的复杂网络。由于镉是植物的非必需元素，因此植物中没有特异性的镉转运体。目前，研究表明，镉可以通过各种转运蛋白以游离镉离子或与配体和螯合剂络合的镉形式共转运，其中，ABC转运蛋白家族是最大的膜蛋白家族之一，位于质膜或液泡膜上，具有广泛的种类和分布以及多种类型的物质，在植物镉的易位和排毒中也起着重要的作用。在本研究中，我们鉴定了两种通过马蔺的镉处理上调的ABCC蛋白（表2）。先前的研究表明，ABCC转运蛋白主要位于质膜或液泡膜上，并且可以将GSH或PC重金属复合物转运到细胞外空间或液泡中。研究者发现拟南芥AtABCC3通过将PCs-镉复合物分离到液泡中来提高对镉的耐受性。由于大多数ABCG亚家族转运蛋白均与多效性耐药性（PDR）相关，因此ABCG转运蛋白也称为PDR蛋白，它在植物对重金属胁迫的耐受性中起关键作用。在我们的研究中，两种PDR蛋白在镉处理的马蔺芽/根中比对照表达更高（表2）。在拟南芥植物中，AtPDR8基因在镉处理下显着上调，而过表达AtPDR8的植物从细胞质中排泄出更多的镉离子，这导致其对镉胁迫的抵抗力比野生型更高。最近，有报道称水稻ABC-G转运蛋白OsABCG36通过将镉转运出水稻根细胞而参与了镉耐受性。根据蛋白质组学分析，已鉴定出的大量ABC转运蛋白可能参与了马蔺幼苗中镉离子的转运和分配。
3.谷胱甘肽代谢参与镉反应
谷胱甘肽(GSH)是一种具有γ-Glu-Cys-Gly结构的三肽，是植物细胞中含量最多的巯基化合物。谷胱甘肽可以与Cd2+离子结合形成复合物，复合物可以被运输到液泡中，参与植物抗氧化剂防御，氧化还原信号转导以及生长和发育过程。因此，已经证明GSH合成代谢是调节植物中镉的解毒和积累的关键途径。在马蔺中，DEPs在GSH代谢途径中最丰富，表明GSH在细胞内镉排毒中起重要作用。谷胱甘肽S-转移酶（GST）可以催化GSH与各种疏水性/亲电性内源性和外源性化合物的结合，在GST的作用下，还原的GSH可以与过氧化物和自由基结合，以抵消氧化剂对巯基的破坏，从而保护含硫醇氧化应激损伤导致细胞膜中的蛋白质和含硫醇的酶。在我们的研究中，镉处理的马蔺中7种GST蛋白的丰度增加（表2）。有研究者发现，与野生型植物相比，过表达GST基因的转基因拟南芥显示出对重金属的耐受性增加。结果表明，GST介导的谷胱甘肽代谢可能与马蔺的镉耐性有关。
4.信号转导通路在镉反应中的作用
信号转导在植物对逆境的反应中起重要的调节作用。研究表明，重金属胁迫可以激活植物激素信号转导途径。在本研究中，我们确定了与镉处理的马蔺和根中的6-苄基氨基嘌呤（BA）生物合成/信号转导有关的两个DEP。最近的研究表明，BA在提高芥菜对镉的耐受性以及对受镉污染的土壤进行植物修复的效率方面起着重要作用。茉莉酸（JA）作为信号分子，在植物重金属胁迫反应中起着重要作用，研究者发现外源JA通过上调AmMT2基因在叶片中的表达来降低了海茄苳的镉毒性。 12-氧代乙二酸酯还原酶（OPR）是JA生物合成途径中的关键酶之一，在植物胁迫反应中起重要作用。在本研究中，我们发现镉处理下马蔺幼苗中有两种OPR蛋白显著上调(表2)，在其他植物中，如水稻和玉米，镉处理也上调了OPR基因，这表明OPR催化的JA合成可能在植物镉反应中发挥重要作用。
植物蛋白激酶在细胞信号传导中起着广泛的作用。在本篇文章中，我们在马蔺幼苗根中发现了许多镉上调的蛋白激酶，包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，失活的受体激酶，丝裂原激活的蛋白激酶（MAPK）和富含亮氨酸的重复序列（LRR）受体样丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（表2）。MAPK信号传导积极参与植物的重金属胁迫反应，有报道称，在拟南芥中，短期镉诱导的ROS激活了MAPK3 / 6，而蔗糖非发酵（SNF）相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（SnRK）可以参与信号转导过程，硫代谢等，并且在植物对非生物胁迫的响应中起重要作用。拟南芥SnRK2s通过控制镉诱导的ROS积累来调节植物对镉毒性的耐受性，镉处理可调节多种蛋白激酶，表明蛋白激酶介导的信号转导可能参与了马蔺幼苗对镉的响应。
5.甘露糖特异性凝集素在镉反应中的作用
凝集素是一种糖结合蛋白，广泛分布于动物，植物和微生物中，可以调节许多生物过程。植物凝集素最初存在于蓖麻籽中，通常仅结合一种单糖或寡糖。凝集素是植物防御系统的重要组成部分，在植物保护中起着关键作用。植物凝集素可分为多种类型，其中甘露糖特异的凝集素家族主要存在于单子叶植物中，研究表明，植物可以在胁迫条件下诱导凝集素的积累。在小麦中，生物和非生物胁迫诱导了木菠萝素相关甘露糖结合凝集素（JRL）基因的表达；此外，凝集素也被认为是参与植物对胁迫条件的响应的信号分子。水稻OsJRL基因的过表达提高了水稻的耐盐性，这与提高转基因植物中胚胎发生晚期丰富蛋白基因和Na+转运蛋白基因的表达水平有关；然而，关于植物凝集素在镉耐性和积累中的作用的报道很少。研究者报道，外源小麦胚芽凝集素预处理通过调节激素水平提高小麦对镉的耐受性，也通过增加木质素积累降低镉在小麦中的积累。在本研究中，我们克隆了一个镉诱导的甘露糖特异性凝集素，并在酵母中进行了异质性表达，结果表明，酵母对镉敏感，体内镉积累显著增加，这些结果表明，不同类型的凝集素可能在植物对镉的反应中具有不同的功能。未来，我们将进一步研究甘露糖特异性凝集素（IlMSL）在马蔺中的生物学功能，以揭示IlMSL在植物耐镉积累中的分子调控机制。
结论