双荧光素酶检测实验原理及步骤

荧光素（Luciferase）是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。在荧光素酶的催化下，荧光素       底物可以高效的转变成氧萤光素，同时发出强烈的光。

鉴于此，研究者利用荧光素酶开发出一套极其灵敏且使用方便的基因报告系统。目前这一系统被广泛用。

两种常用载体类型极其应用场景

●　pGL3-Basic---用于转录因子结合位点与启动子活性分析。把待分析启动子区段构建到F-Luciferase上游，和转录因子共转染分析F-Luciferase活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达R-Luciferase的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率(参考案例一)。

●　psiCHECK2---miRNA与其靶点相关分析,包括miRNA靶基因验证(参考案例二A和B)、lncRNA (参考案例三)与circRNA (参考案例四)吸附miRNA验证等。需要把miRNA潜在结合靶点克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域，然后与待测miRNA共同转染细胞内测定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase （hLuc+）作为校正内参校正不同样品之间转染的转染效率。

双荧光素酶检测技术步骤