丝瓜超氧化物歧化酶(SO D )酶学特性的研究

张前荣 ' 庄尹宏 温庆放 · 刘建汀 1,2,3 朱海生 1

l 福建 省农业科 学院作物 研 究所 ，福州，350013；2 福 建省农业 科学院 蔬菜研 究中心，福州，350013；3 福 建省蔬 菜工程 技术研 究中心， 福州，3500 13

通 讯作者 ．zhs0246@ 163．tom

摘 要  为了研究丝瓜超氧化物歧化酶(superoxidedism utase，SO D )酶学特性，本研究应用分光光度计开展了温度、pH 、酶体积、反应底物浓度等对酶反应 的影响，为丝瓜酶促褐变的研究提供基础 。试验结果表明 SO D酶最优反应体系为：以底物氮蓝 四唑(N B T)为例，最优温度为 40"C ，最适 pH 为 7．8，其底物浓度为 0．08 m ol／L ，最适酶液体积为 0．14 m L ，其根据米氏方程：y=0．002 7X_0．013 (x= lN ,y= l／S)，K m 为 0．207 9 m ol／L 。

关键词 丝瓜，SO D ，酶学特性

丝瓜(Luf f a cylindrc ，又称天罗，是一种 葫芦科丝瓜属 的蔬菜，起源于印度或南亚热带地区。丝瓜具有性凉，清热解毒的保健效果，是一种药食兼用性蔬菜 ，已成为 中国主要的瓜类蔬菜之一 。丝瓜在鲜切及烹饪 的过程 中，常常会 出现果 肉褐 变及菜色褐色 的现象，严重影响了外观品质，甚至影响人们对丝瓜 的食欲(周 向军等，201 1；娄丽娜等，2014，江苏农业科学，42f7)：160．162)。因此研究丝瓜的褐变机理，培育抗褐化的丝瓜品种具有重要的研究意义。

果实褐变可分为酶促褐变和非酶褐变两种。酶促褐变是指在有氧条件下植物体 内的酚类物质通过多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO )的作用 下氧化生成醌类物质，醌类物质经过一系列的反应聚合形成褐色物质而导致组织变色(邹波，2008，黔东南民族职业技术学院学报，3：23—25；C hang，2009；黄树苹等，2009；温庆放等，2016)。在果蔬的褐变过程 中，酶促褐变与组织 内的多酚氧化酶(PPO )、抗坏血酸过氧化物 酶(A PX )、过 氧化 物 酶(PO D )、超 氧 化物 歧 化 酶(SO D )TA]过氧化氢酶(C A T)等酶有密切的关系(Li et a1．，20 15；Fan et a1．．2016)。非酶褐变是指在外界不 良环境条件下果蔬表面与空气 中的氧 气接触 ，使得酚类等物质被氧化 ，造成果蔬 的颜色变深 的现 象(史辉 ，2005；徐芹，2008)。非酶褐变包括焦糖化褐变、多元酚氧化缩合反应、抗坏血酸氧化分解和糖与氨基酸反应等几种类型(徐芹，2008)。

植物在受到逆境时 ，会产生超氧 阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)等物质，会对体内细胞结构和功能产生破坏(陈军等，2015)。超氧化物歧化酶(superoxidedism utase，SOD )是催化植物体内超氧阴离子(O2-) 通过歧化反应转化生成氧气(O2)和过氧化氢(H2O2)的酶，是保护细胞膜系统的关键酶 ，也与丝瓜的褐变有关。陈明媚(2005)等认为果蔗 的 SOD 酶活性减低，褐变程度加剧 ；许宙等(2008)认为新高梨的 SOD 酶与褐变程度呈负相关，新高梨褐变相关酶对褐变影响程度依次为 PPO >PO D >SO D 。本研究开展了温度 、pH 、酶浓度 、底物浓度等对丝瓜超氧化物歧化酶(su．peroxide dism utase，SO D )活性影响，为今后研究丝瓜酶促褐变奠定了理论基础 。

1 结果与分析

1．1 温 度对 SOD 酶 活性 的影 响

试验结果表 明，在温度为 1O℃-~40~C 时，SO D 的吸光值呈现上升趋势 ，酶的活性逐渐增强；当温度为4O℃时，其吸光值达到最大，酶的活性最强；当温度为超过 40℃时，吸光度值减小，酶活性下降，当超过7O℃后时，吸光值很小，酶活性基本上已经失活(图1)。由此可知 ，SO D 的最适温度为 40"C ，其吸光度值为最高，活性最强。

0 ．1 8

O ．1 5

0 ．12

0 ．09

O ．O 6

O ．O 3

O．OO

1O 2O 30 4 0 50 60 7O 80 90

温 度(℃)

T em perature (℃)

图 1 温度对 SO D 活性的影响

Figure 1 E f f ects of tem p erature on SO D activity

6 ．U 6 ．6 7 ．2 7．8 ．4 9 ．U

p H

图 2 pH 对 SO D 活性的影响

Figure 2 Ef f ect s ofpH value Oil SO D activit y

1．3 酶 液体 积对 So D 酶活 性 的影响

试验结果表明，反应时酶的体积也会影响反应速

度 。当 SO D 酶体积在 0．06～0．14 m L 范围内，吸光度

值随着体积增大而增大；当 SO D 酶体积大于 0．14 m L

后 ，吸光度值 略有减小但趋于平稳 ；当酶液体积为

0．14 m L 时，吸光度值最高(图 3)。由此可知，SO D 酶

催化反应时的最适酶液体积为 0．14 m L 。

O．15

0 ．1 2

0．09

O．06

0．03

0．00

0．06 0．0 8 0 ．10 0．12 0 ．14 0 ．16 0．18 O．2O

酶液体积(m E1

Enzym e f luid volum e(m L)

图3 酶液体积对 SO D 活性的影响

Fig u re 3 Ef f ects ofenzym e f luid volum e on SO D activit y

1．4 底 物浓 度对 So D 酶活 性 的影 响

本研究的反应底物为氮蓝四唑(N B T)，当氮蓝 四

唑(N B T )浓度为 0．02-0．08 m ol／L 时 ，吸光值 随着氮

蓝 四唑(N a a3 浓度的增加而增大，SO D 酶的活性也呈

增强的趋势 ；当氮蓝 四唑fN B T)浓度超过 0．08 m ol／L

时 ，略有下降，但趋于平衡(图 4)，当氮蓝 四唑(N B T )

浓度为 0．08 m ol／L 时，吸光度值最大，酶活性也最强；

由此说明，氮蓝四唑(N B T )浓度在反应中的最佳浓度

为 0．08 m ol／L 。用不同浓度反应底物浓度推测酶活性，

丝瓜超氧化物歧化酶(SO D )酶学特性的研究

T h e S tud y on E nzym atic C haracteristics o f S up erox id e D ism utase (S O D ) il1 L u fra 。

得 出线性方 程 y =0．002 7x一0．013，R 2 为 0．926 1，K m

为 0．207 9 m ol／L (图 5)。

善, ~I UU

O．16

0．14

0 ．12

0 ．1 0

0 ．O 8

0．06

0．04

0．02

0 ．O0

0 l0 2O 3O 40 5O 60

I／S

图 5 SO D 催化 N B T 的米氏方程双倒数

F ig ure 5 L in ew eav er-B u rk do ub le recip rocal d iagram o f catalytic

N B T recation by SO D

2 讨 论

膜脂过氧化对植物细胞膜 会造成严重的伤 害，

SO D 酶在植物衰老过程 中起到清 除体内过量 的活性

氧，从而体 内维持活性氧代谢的平衡 ，起到保护膜 结

构，从而防止细胞的衰老，抑制酶促褐变(王君，2006)。

因此研究丝瓜 SO D 酶活性对细胞分解活性氧 的能

力及丝瓜褐变具有重要的关系 。本试验研究结果表

明温度 、pH 、浓度、体积等反应环境对丝瓜酶促褐变

的相关 的 SO D 酶活性 的影 响很大：以底物氮蓝四唑

(N A T)为例 ，最优温度为 40℃，最适 pH 为 7．8，其底

物浓度为 0．08 m ol／L ，最适酶液体积为 0．14 m L ，其根

据米 氏方程：y=0．002 7x-O．013 (X=1／V ，y= l／S)，K m 为

0．2 07 9 m ol／L 。

在酶促反应 中，pH 值和温度的高低，均会影响酶

的催化作用，表现为酶活性先上升后降低的趋势。主

要 因为过高或过低 pH 值及高温度易使丝瓜 SO D 酶

催化不稳定 ，从而引起催化能力下降；同时 SO D 酶

为蛋 白质，过高或过低 pH 值及高温度容易使蛋白质

结构发生变异，从而使酶活性失活(马兰戈尼等，2007；

张楚富，201 1)。而低温度易使酶活性降低(王君，2006)。

本研究中，在反应温度 10℃~4O℃的范围内 SO D 酶 的

活性增强，当温度为 40"C 时酶的活性最强，而超过

4O℃时，酶活性开始下降，而超过 70℃后酶基本失

活。当 pH 在 6．0～7．8 的范围内，SO D 酶活性随着 pH

值升高而增强，当 pH 为 7．8 时，酶活性最强，而超过

酶活性的最适 pH ，酶活性减低 。在催化反应 的过程

中，一定浓度底物(酶)时，增加酶(底物)浓度，能够使

更多 的酶与底物结合 ，从而使得反应生成物生成速

度更快，因此吸光度值就更高。而 当酶(底物)达到最

适合浓度时，底物与酶的结合 已经达到饱和，反应生

成物形成的速度也达到饱和 ，因此吸光度值 曲线趋

于平缓。

3 材料与方法

3．1 试 验材 料

供试材料 为 '黑 12’丝瓜品种 (系)，由福建省农

业科学院作物研究所蔬菜中心提供 。摘取商品果实

清洗后擦干，液氮速冻后置于 一80℃冰箱中储存备用 。

3．2 酶 液提 取

精确称取丝瓜样品 1．000 g，加入 1 m L 预冷磷酸

缓冲盐 溶液(PB S)缓冲液(0．5 m m ol／L ，pH 7．8)，0．5 g

交联 聚乙烯吡咯烷酮(PV PP)，置于冰上 研磨 ，吸取

2 m L 磷酸缓冲盐溶液(PB S)缓冲液冲洗研钵残留的

样品，并收集至离心管中，置于 4"C 1 000 r／m in 离心

20 m in，吸取上清液，即为粗酶液。

3-3 So D 酶活 测定

试验方法参照李合生(2000sssss)：取 50 m m ol／L

pH 7．8 磷酸缓冲盐溶液(PB S)缓冲液 2 m L 置试管 ，

依次加入 13 m m ol／L 蛋氨酸 0．5 m L、175 m m ol／L 氮蓝

四唑 『B T ) 1 m L 、0．1 m m ol／L 乙二氨 四乙酸(ED TA )

0．5 m L 、50 ixm ol／L 核黄 素(C 17H 20N 4O 6)0．2 m L ，最后

加入粗酶液 0．03 m L 混匀 ，于 4 000 Lx 灯光下反应

30 m in 。至 于波长 为 560 nnl 的分光光度计下测定

OD 值 。试验重复 3 次。

3．4 SO D 酶 最适 反应 温度 的研究

同采用 SO D 酶活测定方法，反应混合液混匀后分

别在 10℃、20℃ 、30℃ 、40℃ 、50℃、60℃、70℃ 、8O℃

和 90℃在水浴锅中预热 3 m in 后测定其吸光度 ，研

究反应温度与 SO D 酶活性的相关性。3 次重复。

3．5 pH 对丝瓜 So D 酶活性的影响

同采用 SO D 酶活测定方法，配制 pH 分别为6．0、

ss s6 ⋯

6．6、7．2 、7．8、8．4 和 9．0 的 N aH 2PO } 柠檬 酸缓 冲液 ，

测定 pH 值对 SO D 酶活性的影响，3 次重复。

3．6 酶液浓度对 So D 酶活性的影响

同采用 SO D 酶活测定方法，在 N aH 2PO } 柠檬

酸缓冲液 与底物 的混合 液 中，分别加入 0 ．06 m L 、

0．08 m L 、0 ．10 m L 、0 ．12 m L 、0．14 m L 、0．16 m L 、0．18 m L

和 0．20 m L 的 SO D 酶粗酶液 ，于 40"C 水浴 3 m in 后

测定吸 光度 。aS 重复 。

3．7 底物浓度对 So D 酶活性的影响

同采用 SO D 酶活测定方法，配制浓度为 0． 02 m oFL 、

0 ．04 m ol／L 、0 ．0 6 m ol／L 、0 ．08 m ol／L 、0 ．10 m ol／L 、

0．12 m ol／L 、0．14 m ol／L 和 0．16 m ol／L 的氮 蓝 四 唑

(N B T )浓度溶液 ，加入到 SO D 酶对应反应混合液中，

于 40℃水浴 3 m in 后测定吸光度。

3．8 数 据处 理与 分析

运用 Excel2003 进行数据分析及作图。

作者贡献

张前荣阅撰写论文初稿 ，修改和文章定稿；张前

荣、庄尹宏和刘建汀参与样品制备，开展实验 ，文献查

阅和论文修改。温庆放和朱海生是文章构思者，指导修

改，文章定稿等。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由福建省属公益类科研 院所基本科研专

项(2017R 1026—6；20 15R 1026—9)、福建省农业科学 院

创新团队 PI 项~ (2016PI一40)、福建省农业科学院创新

项 目(2015Q C 一6；PC 2017—7)和所基金项 目(2015Q N 1)

共同资助 。

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