原代细胞的培养与建系(二)

③酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250），但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。④温度 一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6~8.0之间，否则对细胞有损伤。⑥无机盐离子 若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此，在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。⑦消化时间 如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。分离方法如下：①过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。②多次提取消化法 多次提取消化法有以下三种：热消化多次提取--将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。冷消化多次提取--方法同上，只是消化温度为4℃。先热消化后冷消化--将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。（2） 胶原酶（Collagenase）消化法胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表4-2），以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用），采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。表4-1 胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别项 目胰蛋白酶胶原酶消化特性适用于消化软组织适用于消化纤维多的组织用 量0.01%~0.5%0.1~0.3mg/mL（200u/mL）消化时间 0.5~2小时（小块）1~12小时pH 8~96.5~7.0作用强度强烈缓和细胞影响时间过长有影响无大影响血清、钙、镁离子有影响无影响表4-2 胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间（小时）（0.5~1cm3）酶 种 类  较 硬 组 织软 组 织4℃ 室 温 37℃ 4℃ 室 温 37℃胰蛋白酶（0.25%）24~481~61~212~24 1~20.5~1胶原酶（200u/mL） 2466.51230.25两者联合（对冲）12~4612~244~1212~246~121~2除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。2、非酶消化法（EDTA消化法）EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene,全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。消化分离法的操作步骤：（1）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。（2） 加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（3）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（4）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（5）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（6）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。注意事项如下：（1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。（2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。（3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。三、原代细胞的培养方法原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。