摘 要：目的 探讨化瘀通络中药对糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）大鼠肾脏的保护作用以及对腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated proteinkinase，AMPK）/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamideadenine dinucleotide phosphatase oxidase 4，Nox4）信号通路的干预作用。方法 随机选取7只SD大鼠作为对照组，其余大鼠采用高糖高脂饲料喂养联合ip链脲佐菌素（35 mg/kg）建立DN模型，DN大鼠随机分为模型组、化瘀通络中药（4.41 g/kg）组和厄贝沙坦（13.5 mg/kg）组。给予化瘀通络中药16周后，取尿液检测大鼠24 h尿蛋白（urine total protein，UTP）和8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）水平；考察各组大鼠肾组织病理变化；考察各组大鼠肾组织超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和丙二醛水平；采用免疫组化法检测各组大鼠肾组织8-OHdG和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）蛋白表达；采用qRT-PCR法检测肾组织转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）mRNA表达；采用Western blotting法检测各组大鼠肾组织TGF-β1、AMPKα、磷酸化AMPKα（p-AMPKα）、Nox4蛋白表达。结果 与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠尿液24 h UTP和8-OHdG水平明显降低（P＜0.01）；肾脏病理损伤缓解，肾组织细胞外基质（extracellularmatrix，ECM）堆积减少，肾组织胶原面积明显降低（P＜0.01）；肾组织SOD活性明显升高（P＜0.05），肾组织丙二醛水平显著下降（P＜0.01）；肾组织8-OHdG和FN表达减少；肾组织TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01）；肾组织p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），Nox4蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。结论 化瘀通络中药能够通过作用于AMPK/Nox4信号通路，从而抑制DN大鼠氧化应激、减少ECM大量堆积、降低UTP排泄、保护肾脏。
糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是导致慢性肾功能衰竭的主要原因之一，为肾脏透析和移植的主要适应证[1-2]。中医药对改善DN临床症状、提高患者生存质量有良好效果。课题组以中医理论为基础并结合多年临床实践，认为瘀血阻络证是贯穿DN病程始终的独立病机[3-4]。化瘀通络中药为临床治疗DN的复方中必不可少的一部分，课题组前期研究发现，化瘀通络中药配伍应用能够显著降低DN大鼠尿蛋白，延缓肾脏病理损伤[5-7]。氧化应激在DN的疾病进展中起着重要作用[8]。过量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）通过促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的积累参与DN的发病，最终导致肾脏纤维化[1]。ROS主要由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶介导产生[9]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）能够抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamideadenine dinucleotide phosphatase oxidase 4，Nox4）过表达[10]，改善高脂饮食和糖尿病引起的氧化应激[11-12]，抑制转化生长因子-β1（transforminggrowth factor-β1，TGF-β1）介导的纤维化[13]。因此，本研究探究化瘀通络中药能否通过作用于AMPK/Nox4信号通路，从而抑制DN大鼠氧化应激、延缓肾脏纤维化。
1 材料
1.1 动物
SPF级雄性SD大鼠40只，体质量60～80 g，21～34日龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0006。动物饲养于温度23～25 ℃、湿度50%～70%的环境中，自由进食饮水。动物实验经河北中医学院伦理委员会批准（批准号DWLL2015002）。
1.2 药品与试剂
1.3 仪器
BX63＋DP72正置研究级显微镜（日本Olympus公司）；NanoDrop 2000C紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Stepone plus荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；Infinite 200多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；LI-COR红外激光扫描仪（美国Odyssey公司）。
2 方法
2.1 造模、分组与给药
40只雄性SD大鼠给予普通饲料适应性喂养1周，检测其血糖和尿蛋白均为阴性。随机选取7只SD大鼠作为对照组，予以普通饲料喂养；其余大鼠用高糖高脂饲料喂养6周后，ip链脲佐菌素溶液，（35 mg/kg），72 h后尾静脉取血3次，检测大鼠随机血糖均≥16.7mmol/L，DN模型制备成功。2只大鼠血糖不达标予以剔除，3只大鼠ip链脲佐菌素溶液72 h内死亡。DN大鼠随机分为模型组、化瘀通络中药（4.41 g/kg）组和厄贝沙坦（13.5 mg/kg）组。化瘀通络中药组丹参、川芎、地龙、水蛭、全蝎剂量分别为1.35、1.08、0.9、0.54、0.54 g/kg（以中药饮片量计），相当于临床等效剂量，以上5种颗粒按剂量配比混匀，溶于纯净水配制成质量浓度为0.49 g/mL的溶液；厄贝沙坦分散片溶于纯净水配制成质量浓度为1.5 mg/mL的混悬液。各给药组ig相应药物（9 mL/kg），对照组和模型组ig等体积纯净水，1次/d，连续16周。
2.2 化瘀通络中药对DN大鼠24 h尿蛋白（urine totalprotein，UTP）和8-OHdG水平的影响
给药结束后，大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，测量尿量，混匀并留取1mL，终点法检测UTP和8-OHdG水平。大鼠脱颈椎处死，取肾组织于福尔马林-醋酸-酒精（FAA）固定液中固定24 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后切片，进行PAS和Masson染色，于显微镜下观察肾组织病理变化，并采用Image-Pro Plus6.0分析软件对Masson染色的病理切片进行分析，计算胶原面积。
2.4 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织SOD活性和丙二醛水平的影响
取各组大鼠肾组织匀浆，按试剂盒说明书检测各组大鼠肾组织SOD活性和丙二醛水平。
2.5 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织8-OHdG和FN蛋白表达的影响
取各组大鼠肾组织石蜡切片，使用微波进行抗原修复，加入3% H2O2用来阻断内源性过氧化物酶，滴加血清封闭，加入8-OHdG、FN抗体（1∶200）孵育过夜，滴加HRP标记的山羊抗兔抗体，使用DAB显色、复染后封片，于显微镜下观察并拍照。
2.6 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织TGF-β1 mRNA表达的影响
按照试剂盒说明书提取各组大鼠肾组织总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAAC- AAC-3’，下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAA- AGC-3’；GAPDH上游引物5’-CTGGAGAAACCTG- CCAAGTATG-3’，下游引物5’-GGTGGAAGAATG- GGAGTTGCT-3’。
2.7 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织AMPKα、p-AMPKα、Nox4和TGF-β1蛋白表达的影响
取各组大鼠肾组织，加入RIPA裂解液匀浆，提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入脱脂牛奶于室温封闭，分别加入AMPKα抗体（1∶800）、p-AMPKα抗体（1∶1000）、Nox4抗体（1∶1000）、TGF-β1抗体（1∶600）和β-actin抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔抗体（1∶3000），室温孵育30 min，加入ECL试剂显影，采用Quantity one软件分析目标条带的灰度值。
2.8 统计学分析
采用SPSS 21.0软件进行统计学处理，数据以表示，组间比较采用One-way ANOVA。
3 结果
3.1 各组大鼠的一般情况
对照组大鼠活泼灵敏，模型组和各给药组大鼠精神萎靡、反应迟钝，其中模型组大鼠表现最为明显。给药过程中，模型组死亡3只大鼠，化瘀通络中药组和厄贝沙坦组各死亡2只大鼠。
3.2 化瘀通络中药对DN大鼠24 h UTP的影响
如表1所示，与对照组比较，模型组大鼠24 h UTP明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠24 h UTP显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.3 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织病理变化的影响
如图1所示，对照组大鼠肾脏结构清晰；模型组大鼠肾小球肥大、囊腔变窄，部分出现球囊粘连，肾小球基底膜明显增厚，系膜基质重度增生，小管间质ECM明显沉积；各给药组大鼠肾脏病理损伤均有不同程度好转，且肾组织ECM堆积减少。与对照组比较，模型组大鼠肾组织胶原面积占比明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织胶原面积占比明显降低（P＜0.01）。
3.4 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织SOD活性和丙二醛水平的影响
如表2所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织SOD活性明显下降（P＜0.01），丙二醛水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，化瘀通络中药组大鼠肾组织SOD活性和丙二醛水平明显升高（P＜0.05、0.01），厄贝沙坦组大鼠肾组织SOD活性明显降低（P＜0.05）。
3.5 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织8-OHdG蛋白表达和尿液8-OHdG水平的影响
8-OHdG是DNA的一种氧化嘌呤残基，是氧化性组织损伤的标记物[14]。糖尿病患者尿液中8-OHdG水平与DN疾病进展密切相关[15]。如图2所示，8-OHdG主要在肾小球和小管的细胞核表达，与对照组比较，模型组大鼠肾组织8-OHdG表达增加，尿液8-OHdG水平明显增多（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织8-OHdG表达减少，尿液8-OHdG水平显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.6 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织FN蛋白表达的影响
如图3所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织FN表达增加；与模型组比较，各给药组大鼠肾组织FN表达减少。
3.7 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织TGF-β1mRNA和蛋白表达的影响
如图4和表3所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组肾组织TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.8 化瘀通络中药对DN大鼠肾组织AMPKα、p-AMPKα和Nox4蛋白表达的影响
如图5和表4所示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织p-AMPKα/AMPKα蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），Nox4蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组p-AMPKα/AMPKα蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），Nox4蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。
4 讨论
本研究采用高糖高脂饲料喂养联合ip链脲佐菌素溶液建立DN模型，发现造模大鼠血糖升高，并出现了UTP升高和肾脏病理损伤。目前针对DN的现代医学治疗手段主要为严格控制血糖与血压。厄贝沙坦作为血管紧张素受体拮抗剂类的降压药物，大量临床随机对照试验表明厄贝沙坦具有肾脏保护作用，能够减少早期和中晚期DN患者UTP，延缓肾脏病变[16-17]。因此，本研究选用厄贝沙坦作为阳性对照药物，研究化瘀通络中药对DN大鼠的保护作用。DN作为糖尿病的严重微血管并发症，其主要临床表现为大量蛋白尿，主要病理表现为ECM增生，ECM积聚导致肾小球和肾小管基底膜增厚，最终发展为肾小球硬化和小管间质纤维化。TGF-β1是糖尿病中导致肾脏ECM积累的关键细胞因子[18]，过度表达的TGF-β1使ECM如I、III、IV型胶原及FN和层黏连蛋白（laminin，LN）等大量积聚，同时刺激蛋白酶抑制剂、纤溶酶原活化抑制剂合成，使ECM降解减少，最终导致肾脏纤维化[19-20]。研究发现，由于ROS产生过多引起的肾脏氧化应激是导致TGF-β1高表达和ECM增生的主要原因之一[21]；由Nox4衍生的ROS为引起糖尿病早期阶段氧化应激的主要原因，能够导致糖尿病肾脏肥大和ECM表达增加[22]；在高糖环境下暴露的系膜细胞和小管细胞中，Nox4的上调与TGF-β1、FN的升高有关[23]。AMPK为细胞的能量传感器，负责调节并维持机体的糖脂代谢和能量代谢平衡[24]。AMPK作为与肥胖、糖尿病和代谢综合征相关疾病的治疗靶点，受到广泛关注[25]。研究发现，糖尿病小鼠肾脏中AMPK表达降低，DN患者肾组织p-AMPK蛋白表达明显减少；AMPK激活剂可以改善DN相关的临床与病理改变，降低UTP，下调TGF-β1表达，减少ECM积聚，从而改善DN肾脏纤维化[12]。AMPK不仅是细胞的主能量传感器，也是细胞内的主ROS传感器[26]。AMPK激活后可以阻断Nox4，减少ROS生成，降低UTP排泄和基质蛋白表达[27-28]。AMPK是1种异源三聚体蛋白，由催化亚基α和调节亚基β、γ组成，其中α亚基在哺乳动物肾脏中广泛表达，且AMPK的激活需要α亚基上的苏氨酸残基（Thr 172）参与[29]。因此，本研究通过检测大鼠肾组织AMPKα和Nox4蛋白表达情况，来评估AMPK/ Nox4信号通路对DN肾脏纤维化的影响。糖尿病属于中医消渴的范畴，其基本病机为气阴两虚、消渴日久、气虚无力推动血行而致瘀；阴虚生热、热灼津液、津亏血少、脉道充养不足同样致瘀，瘀血不仅是病理产物，同时也是致病因素，其阻于肾络，发为DN。因此，课题组认为瘀血阻络是DN的基本病机。现代药理学研究表明ECM增生作为DN的主要病理改变与血瘀证有明显的相关性[30]，经过化瘀通络治疗可以显著降低肾络瘀阻患者血清TGF-βl、LN和IV型胶原水平[31]。课题组前期研究表明，化瘀通络中药可以明显改善DN大鼠的肾脏病理表现，下调ECM蛋白表达，延缓肾脏纤维化[32-33]。化瘀通络中药可以改善DN患者临床症状，且疗效可靠[34-35]。活血化瘀类中药复方制剂—丹参川芎嗪注射液可以明显改善血液流变学异常[36]；消癥通络类中药—地龙与水蛭合用具有改善微循环、增加肾血流量、促进纤维蛋白溶解、抑制血小板聚集的作用[37]；全蝎可以促进纤溶系统的激活，从而抗栓、溶栓[38]。因此，本研究选用活血化瘀之草本代表药物丹参、川芎和消癥通络之虫类代表药物地龙、水蛭、全蝎，5药合用，共奏化瘀通络之功。本研究结果显示，化瘀通络中药能够明显降低DN大鼠的UTP，下调TGF-β1和FN的表达，减少ECM堆积，延缓肾脏纤维化进程；增加SOD活性，减少丙二醛水平，降低尿液8-OHdG排泄及其肾脏表达，抑制氧化应激；上调p-AMPKα蛋白表达水平，下调Nox4蛋白表达水平。综上所述，AMPK/Nox4信号通路可能是化瘀通络中药减轻肾脏氧化损伤、减少ECM增生、延缓肾脏纤维化、保护DN肾脏的作用靶点之一。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：李雅纯，方 敬，杨 帆，郭 帅，陈志强．化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾脏和AMPK/Nox4信号通路的作用研究 [J]. 中草药, 2021, 52(11): 3278- 3285.
