二代测序 之 123...

写在前面：

二代测序  之1. 概念

二代测序也叫下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS），下一代测序的概念是相对一代测序而言的。（举个例子讲：测序就好比读一本书。一代测序由于读书的条件等限制，最多一次只能读1页；而二代测序，在读这本书之前会先把这本书拆分成很多页，一次就可以同时读取不同页的内容，然后再把读到的每页拼在一起，快速的读完这本书。），也叫高通量测序，同上边例子，二代测序其时间明显变短；通量，即一次“读书”的量，显著增加；而且测序成本更低。

二代测序  之2. 实验流程

图1、gDNA&cfDNA文库构建流程图

简单介绍一下每个步骤的作用：

①提取基因组DNA（genomic，DNA）：这一步最好保证提取的gDNA的纯度较好，即A260/A280=1.8—2.0之间，A260/A230没有严格的要求。

②片段化：因为二代测序仪读长较短，所以要将gDNA进行片段化；常见的方法有超声波随机打断和酶消化的方法。针对血浆中cfDNA，因其片段本来就较短（100-200bp之间），所以就可以跳过片段化直接进行末端修复。

③末端修复加“A”：因为片段化后的片段有粘性末端和平末端，所以要进行末端修复补齐；加A的作用，主要是和接头上的T碱基配对，也是方便下一步接头的连接。

④连接接头、筛选：每个接头上有固定的index，可以识别该样本，便于后续生信分析，除此之外，PCR扩增引物、测序引物结合位点等都在接头上；筛选的主要目的是把没有连接上的接头等其他去掉，防止影响后续的PCR扩增。

⑤PCR扩增：对连接上接头的片段进行PCR扩增。

⑥文库纯化：文库中有不同长短的片段，扩增完成后纯化去掉多余的引物、dNTP、盐离子等杂质，得到该样本较纯的文库。

二代测序  之3. 待续