NCBI使用教程--qPCR 引物设计
NCBI设计qPCR引物主要用到Primer designing tool
一/打开基因序列页面
二/点击Pick Primers，跳转到到Primer designing tool的页面到Primer designing tool的页面。
*如果已经有了基因的序列，可以不通过基因查找页面，直接进入Primer designing tool。具体的入口是NCBI——BLAST——Primer-Blast。
三/根据公式对将设计出的引物进行参数设计
① PCR Template
通过查找序列转到Primer designing tool的，那么在PCR Template栏中则会自动出现您的基因的编号，比如对于human β-actin来讲，其mRNA的页面点击Pick Primer之后，PCR Template栏中会出现其对应编号：NM_001101.3。如果是直接进入Primer designing tool界面，则需要将目的基因的编号或者序列粘贴进该框中。在右侧的Range栏中，可以设定正反向引物的结合范围。
② Primer Parameters
引物参数栏中，前两行是引物的序列栏，用于对已有的引物进行特异性分析，在设计引物的过程中并不会用到，因此留空即可。在PCR product size一行中，可以设定PCR引物的扩增产物长度范围，对于qPCR来讲，范围设为50~250时结果比较精确，可以先设定一个较小的范围，如80~150，如果该范围内没有设计出比较好的引物，则可以返回扩大产物大小范围。
# of primers to return是指软件设计引物的数量(如果有的话)，默认为10对。引物的Tm值一行中，可以设定引物的最大、最小和最佳Tm值，以及正反向引物Tm的最大差值。对于qPCR来讲，默认的即为最佳Tm值60°C，不需做任何修改。
③ Exon/intron selection
在抽提RNA的过程中，样本中的基因组DNA污染会显著影响最终的结果，虽然可以使用DNase I进行处理将RNA样本中的中DNA降解掉，但是很难保证DNA降解完全。
由于真核生物的基因组由内含子和外显子组成，而成熟的mRNA仅包含外显子而没有内含子，因此，在设计qPCR引物时，经常会选用跨外显子的方法进行设计，从而保证该引物不会对基因组DNA进行扩增。
在Primer Design Tool中，我们可以进行跨外显子设置，该设置有三个不同的选项，分别代表：对跨外显子无要求、一对引物中至少一条一定要跨外显子以及引物可以不跨外显子。
要注意，选择后两项时，PCR模板栏中必须要填写NCBI中序列的登录号，如mRNA的NM号，以便于程序识别其中的外显子拼接位点。如果手动粘贴序列，则会因为无法定位外显子而设计失败。（低阶选手直接选 no preference，影响不大）
Exon junction span一栏的下方可以对引物跨外显子的其他参数进行调整，如跨外显子引物在前后两个外显子的配对碱基数、内含子长度、扩增产物是否允许在统一外显子上等。
④ Primer Pair Specificity Checking Parameters
良好的引物特异性能够保证在qPCR过程中只扩增出目的基因的片段，而不会出现非特异性结合与扩增产物，这对保证qPCR结果的真实可靠是至关重要的。除了在qPCR最后一步添加熔解曲线检测步骤，我们更应该在设计引物的时候就保证引物的特异性，哪怕仅仅是在软件预测的层面上。
Primer Design Tool的最后一部分参数设置就是针对引物特异性检测的。首先，要确保Specificity check一栏中已经打勾。
Search mode一般选择Automatic即可，这样当用户输入的模板在比对的数据库中有很多相似的序列时（比如一段DNA序列在多个转录变体中都有），用户可以选择哪一些是需要检测的PCR模板。
Database是指特异性检测所用到的数据库：对于常用的检测基因表达上下调变化，一般选择Refseq mRNA，因为此时PCR模板是mRNA的逆转录产物；若要检测lncRNA，该数据库就应该选择覆盖面更广的Refseq RNA。若模板是基因组，则应该选择Refseq representative genomes。
在Exclusion行中，可以对预测的序列以及环境/不可培养样本序列的干扰。Organism是指样本所属物种，将物种名称如：Homo sapiens(或直接human)输入，选择候选栏中对应的物种即可。也可以直接输入物种ID (常用的如：人9606，小鼠10090，大鼠10114)。
在Organism下方，可以对特异性要求的严格程度进行设置，比如引物对非特异结合位置至少要有几个不匹配碱基等。在Splice variant handling一栏中，我们可以勾选上，使得引物由“转录本特异”变为“基因特异”，即能与该基因的多个转录变体结合。但需要注意的是，该选项只能保证设计出的引物可以结合多个转录变体，但并不能保证所有的转录变体都能检测到。
⑤ 高级参数设置
在Advanced parameters中，我们可以进一步对引物的参数信息进行调整，如特异性检测参数、引物长度、GC含量范围等等。其中比较常用到的是最后一项：内部杂交寡核苷酸(Internal hybridization oligo)，可以在此进行Taqman探针的设计。（影响不大）
虽然上面罗嗦了这么多，但实际上大多参数在Primer designing tool中已经预设好了，无需做任何改动。绝大多数情况下，我们只需要调整PCR产物大小、引物Tm值、物种等参数即可。参数设置结束之后，点击“Get Primers”，即可等待结果的出现了。
四/引物选取，在讲选取之前首先说明一下，点击Get primers之后会出现缓冲页面即运算页面或者转录本mRNA 确定页面，缓冲页面你只需要等就OK，转录本页面就选你的转录本就OK，不懂就全选。
引物选取，这里以人的GAPDH为例，该基因有四个转录变体，将转录变体的共有序列粘贴到序列框中，产物大小设置为80-150 bp，另外为了保证引物质量，将Max Poly-X设置为3，即引物中不能出现超过三个以上连续相同碱基。
点击Get Primers，系统会对这段序列进行Blast，弹出以下界面让您选择对应的转录本，由于我们粘贴了共有序列，因此四个转录本都会列出，这里点击“All”将这四个都选中，之后点击Submit提交。
经过一段时间的等待，我们得到了NCBI设计的引物序列，如下图所示有三对引物，每一对引物的特性和序列都罗列其中。
引物的特性有以下几个方面：序列、模板链、长度、起止位置、Tm、GC含量、自我互补能力、产物大小以及引物对应的模板。
其中多数特性都或多或少影响了引物的好坏，比如：序列中最好不要出现连续的相同碱基（尤其在3端）；正反向引物的Tm值要接近；以Oligo dT引物进行逆转录时，引物的起止位置要尽量靠后；引物对的自我互补配对打分要尽量低。根据上述几个简单规则，很快就能够在NCBI反馈的结果中挑取到合适的引物了。
当然，所有这些引物特性都是根据公式打分得到的，只是起到了建议的作用，并不能代表该引物的实际使用情况，特性好的引物在实际使用过程中不一定表现优秀，反之特性不好的引物也不一定不能够使用。
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