Nature：人类癌细胞系转移图谱
2020年12月麻省理工学院和哈佛大学博德学院Todd R. Golub于Nature发表文章A metastasis map of human cancer cell lines，作者通过研究乳腺癌脑转移的分子基础来证明MetMap的实用性--这是此类癌症患者死亡的主要原因。能够转移到大脑的乳腺癌显示出脂质代谢改变的证据。这些细胞中脂质代谢的紊乱抑制了脑转移的发展，提出了一种抗击这种疾病的治疗策略，并证明了MetMap作为支持转移研究的资源的实用性。
人类癌细胞系一直是癌症研究的推动力，导致致癌机制和治疗靶点的发现。然而，对细胞系的大规模表征一直局限于基本读数，如细胞培养中的活力，因为更复杂的表型(如体内行为)一直难以规模化处理。相比之下，大多数转移研究只依赖于少量的实验模型，因此很难推断人类肿瘤遗传多样性的研究结果。
理想情况下，使用异种移植模型构建数百个人类癌细胞系器官特异性转移潜能的图谱是可能的，这样细胞系的分子特征就可以与它们在器官特异性微环境中生存和增殖的能力相关。然而，单独对每种细胞系进行体内测试的前景并不诱人，因为这是劳动密集型的，成本也很高，而且很难充分控制动物实验之间的变异性。作者提出，如果细胞系被标记上分子条形码并注射到受体小鼠体内作为一个池，内部控制的转移潜能可以以高度可扩展的方式进行评估。
为了测试体内条形码监测小鼠不同组织生长的可行性和可靠性，作者使用四种乳腺癌细胞株进行了一项初步研究(图1A)。每个细胞系都被设计成表达一个独特的26核苷酸条形码，连同用于活体成像的荧光素酶和GFP或mCherry，以便于随后的细胞分选和单个小鼠内重复性的测量。将这8条条形码作为一个池注射到5-6周龄NOD-SCID-γ(NSG)小鼠的左心室，重点分析肿瘤细胞退出循环和在远处器官中扩张的能力。生物发光成像(BLI)显示全身的转移性病变。注射5周后，收集脑、肺、肝、肾和骨，使用GFP或mCherry通过荧光激活细胞分选(FACS)分离人肿瘤细胞，并使用RNA测序(RNA-seq)对条形码进行定量(扩展数据图1C-G)。虽然注射前条形码的丰度相似，但一些条形码在特定器官中富集。不同的细胞系表现出不同的转移扩散模式，但每个细胞系表现出高度相似的跨多个小鼠的扩散模式，无论使用的是GFP还是mCherry版本，这证明了这种汇集方法的重复性。例如，HCC1954在脑内的检出率最高，而颅外转移以MDAMB231为主。由批量RNA-seq量化的条形码通过逆转录定量PCR(RT-qPCR)和单细胞RNA-seq独立验证。
图1：条形码细胞体内可扩展转移潜能图。
在验证了该方法之后，作者接下来在癌症细胞系百科全书(CCLE)中描述了所有21个基底样乳癌细胞系的转移行为。基底样癌已知在患者中有不同的转移能力。反映了这种多样性，细胞系表现出不同的转移模式：泛转移、优先转移到特定器官或不转移(图1B)。值得注意的是，一个细胞系(BT20)在多个器官中被检测到，但在所有器官中的丰度都非常低，这反映了它的定植能力，但不能扩张。为了验证在体内联合系统中观察到的转移模式，作者选择了8个细胞株进行单独鉴定，并从联合筛查和单独筛查中观察到类似的结果。
一张500个人类癌细胞系的转移图谱已经证明了它在乳腺癌中的可行性，作者试图将转移潜能的图谱扩大到不同谱系的人类癌细胞系。为了便于高通量分析，作者使用了用于体外药物敏感性筛选的PRISM方法的条形码细胞系。简化的工作流程使得能够定量检测粗组织裂解物中的条形码，而不需要基于FACS的肿瘤细胞纯化。作者将这种方法应用于跨越21个谱系的503个细胞系，以开发第一代转移图(MetMap)(图2A)。
图2：绘制500个人类癌细胞系的MetMap
为了测试MetMap数据集的稳健性，作者以两种格式测试了细胞系：在一种格式中，作者将所有498个细胞系作为一个单独的池进行注射；在另一种格式中，作者注入了5个池，每池25条线，每个池都被注射到不同的小鼠体内(分别称为MetMap500和MetMap125)(图2B)。作者同样改变了细胞数量、小鼠年龄和队列大小，以确定结果是否因这些参数而有很大不同。
尽管实验条件不同，但作者观察到转移潜能之间有很强的相关性(图2C)，这表明该方法是非常稳健的。作者还注意到，与皮下注射相比，心内注射能够在体内评估更多的细胞系。具体地说，作者在心内注射后平均每只小鼠恢复了197个细胞系，而皮下注射后平均恢复了42个细胞系。作者怀疑这种差异是由皮下环境中对营养素和其他微环境因素的局部竞争造成的，而通过心内途径输送的肿瘤细胞的空间分离使这种竞争最小化。在原位实验中也观察到了类似的多样性降低，将9个乳腺癌细胞株注入乳腺脂肪垫，导致单个细胞系主导所产生的肿瘤。
图3：转移潜能的临床相关性
为了确定MetMap是否反映了人类癌症的转移行为，作者分析了细胞系的可用临床注释(图3A-E)。作者发现肿瘤谱系、细胞系来源(原发肿瘤与转移病变)和患者年龄有统计学意义的相关性。转移潜能与性别或种族无关。正如预期的那样，某些肿瘤类型的转移潜能更高，例如黑色素瘤和胰腺癌，这也倾向于在人类疾病背景下发生转移。相比之下，来自脑瘤的细胞系通常是非转移性的，反映了它们不会经历血源性扩散的倾向。
同样，DU145前列腺癌细胞系，来源于脑转移灶，在作者的实验系统中显示出脑转移。来自转移的细胞系显示出比来自原发肿瘤的细胞系更高的转移潜力，尽管来自已知后来在患者中产生转移的原发肿瘤的细胞系在MetMap中是转移的(图3B)，这与先前报道的转移潜力已经在原发肿瘤中编码的建议一致。转移潜力降低和患者年龄增加之间的联系是意想不到的(图3C)，其基础仍有待确定。也许最重要的是，在个体谱系中观察到了转移潜能的广泛差异，这使得寻找转移倾向与肿瘤基因组特征之间的联系成为可能。值得注意的是，转移潜能不能简单地用增殖率或突变负荷来解释(图3F-h)，这表明转移涉及更微妙的分子决定因素。
脑转移的分子相关性为了发展机制洞察力，作者关注乳腺癌及其脑转移的潜力(图1B)，因为脑转移是一些-但不是全部-乳腺癌的一个特征，人们对可能影响治疗方法的潜在因素知之甚少。因此，作者利用每个细胞系的基因组数据，对区分脑转移株和非转移株的分子特征进行了系统和公正的比较。在体细胞突变的水平上，PIK3CA是最相关的：7个脑转移株中有4个含有PIK3CA突变，而14个非转移或弱转移株中0个含有PIK3CA突变(图4A)。
图4：基底细胞样乳腺癌脂质代谢状态改变与脑转移潜能相关。
第五个品系HCC70在PTEN中有功能缺失突变。PI3K是ERBB2(也被称为HER2)的主要下游介质，据报道，ERBB2本身与人类的脑转移有关。事实上，两个脑转移细胞系(JIMT1和HCC1954)也含有典型的ERBB2基因扩增。在DNA拷贝数水平上，作者观察到转移潜能与染色体8p12-8p21.2(简称8p)缺失之间的关系(图4B)。7个脑转移性乳腺癌细胞系中有5个在该区域存在缺失，而14个非转移性乳腺癌细胞系中只有0个。第六个转移株JIMT1在这个通常缺失的区域内有一个小的缺失。
为了确定这些相关性的临床相关性，作者分析了可获得转移信息的乳腺癌临床数据集。作者在METABRIC和TCGA数据集中观察到8P拷贝数与基因表达之间的强烈相关性，从而验证了8P表达在拷贝数数据不可用的数据集中作为拷贝数替代品的有效性。8p基因的协同表达将肿瘤分成两个簇，低表达的簇显示脑转移丰富，脑无转移生存率较低。虽然8p丢失在基底亚型乳腺癌中更为常见(已知预后不佳)，但8p丢失仍然与基底肿瘤内的脑转移显著相关。在其他亚型中也出现了类似的趋势，但样本量太小，无法达到统计学意义。与这些发现一致的是，与颅外转移瘤或原发肿瘤相比，脑转移瘤的8p-low信号明显丰富。同样，作者观察到表明PI3K激活的反应信号与脑转移相关。PI3K-高信号倾向于与8p-低信号同时出现，重叠事件捕捉到大多数脑转移患者。这些结果证实了MetMap发现实验系统的有效性。
脂质代谢和脑转移证实了这些遗传发现，表达分析显示在脑转移细胞系中PI3K和ERBB2信号丰富(图4C)。此外，作者观察到脑转移潜能和脂质合成特征之间有很强的相关性(图4C)，据报道这与PI3K激活和8P缺失有关。为了研究脂质代谢在乳腺癌脑转移潜能中的潜在作用，作者分析了细胞系29中脂质代谢产物的丰度。作者观察到高度脑转移细胞中胆固醇含量的增加(图4D)。除了胆固醇，包括磷脂酰胆碱和鞘磷脂在内的膜脂也同样丰富，与戊糖磷酸途径30相关的代谢物也是如此，它可以支持胆固醇和脂质的合成。相反，作者观察到脑转移细胞中三酰甘油(TAG)水平的整体下降(图4D)。非脑转移细胞的TAG和TAG水平较高。含有脂肪酸氧化特征(图4C)。正常小鼠组织的代谢物图谱显示，与其他组织相比，大脑的TAG水平明显较低(图4e)。这反映了大脑的生理学，大脑不是储存脂肪酸作为标签，而是积累专门的脂质来支持神经活动和大脑功能。一种可能性是，为了让乳腺癌细胞在大脑微环境中存活，而其他组织中存在的标签和其他储存脂质并不丰富，它们必须根据种子和土壤假说，通过从头合成或另一种途径获得脂质。
为了进一步研究具有脑转移能力的乳腺癌细胞系的特征，作者分析了全基因组CRISPR-Cas9活性筛选数据，以确定与脑转移状态相关的基因脆弱性。作者发现SREBF1与脑转移的相关性最高(图4F)。SREBF1是介导PI3K途径下游脂质合成的关键转录因子。与脑转移潜能较低或无脑转移潜能的乳腺癌细胞相比，SREBF1被选择性地用于脑转移细胞系的生长。这种关联是特定于大脑的，因为没有观察到SREBF1的重要性与其他器官转移之间的关联(图4F)。这种SREBF1与乳腺癌脑转移的关联也在MetMap500数据集中被发现，这表明该发现具有很强的重复性。值得注意的是，SREBF1副基因SREBF2显示其在培养中的重要性和转移潜能之间没有关联(图4G)。
为了研究SREBF1在影响脑转移细胞中观察到的脂质表型中的作用，作者用CRISPR-Cas9敲除了JIMT1和HCC1806细胞中的SREBF1，然后进行了脂质组学研究。
SREBF1基因敲除导致细胞内脂质含量显著变化，包括胆固醇、膜脂和二酰甘油水平的下降(图4H)。SREBF1基因敲除还导致细胞内标签水平的增加，可能是通过清除添加到培养基中的富脂血清中的标签来实现的。为了验证这一假设，作者在脱脂血清准备的培养基中重复了实验，这防止了在SREBF1基因敲除细胞中观察到的标签的增加。
图5：乳腺癌脑转移中脂代谢基因的研究
为了进一步探索SREBF1的作用，作者在SREBF1敲除后进行了RNA-SEQ，发现SCD35是下调幅度最大的基因(图4I)。与此一致的是，在全基因组CRISPR-Cas9活性筛选中，SCD是SREBF1在688个细胞系中的最高相互依赖性(图4J)。得分第二高的SREBF1相关性是SCAP，它编码SREBF1的上游激活子。在体外培养或在大脑中生长的乳腺癌细胞的基因表达的比较同样表明，在大脑中，细胞采用脂肪生成、脂肪酸代谢和异体代谢的基因表达特征。与其他转移部位相比，脂质代谢特征的丰富(包括SREBF1和SCD的上调)在大脑中是独一无二的。与颅外转移瘤或其匹配的原发肿瘤相比，患者脑转移瘤中也观察到类似的上调。此外，在小型池和单个基因敲除实验中都证实了SREBF1、SCD、SCAP和其他脂质代谢途径成员形成脑转移所需的条件(图5a-c)。总之，这些遗传、代谢、转录和功能基因组证据都表明SREBF1介导的脂质代谢与脑转移之间存在关联。
考虑到SREBF1基因敲除在体外导致了活性缺陷，作者比较了基因敲除对不同器官转移的相对影响，以确定活性缺陷是否在大脑中优先观察到(图5D)。心内注射SREBF1基因敲除细胞5周后，作者观察到脑转移瘤有明显的缺陷(减少196倍)，而其他器官有轻微的缺陷(9-21倍)(图5D)。对异种移植小鼠大脑的组织学检查显示，接受野生型细胞的小鼠有较大的转移灶，而接受SREBF1基因敲除细胞的小鼠含有微转移灶，这表明SREBF1不是大脑种子所必需的，而是大脑微环境中的增殖所必需的。与这一假设一致，将肿瘤细胞注入颈动脉增加了种植大脑的可能性，但在SREBF1基因敲除细胞中仍观察到明显的生长缺陷(图5e)。
为了确定SREBF1对乳腺癌在脑内生长的要求的普遍性，作者使用CRISPR-Cas9敲除了其他脑转移株包括HCC1954、MDAMB231和HCC1806中的SREBF1。与JIMT1一样，在这些细胞系中也观察到了对脑转移生长的显著抑制，尽管生长抑制的幅度和持续时间各不相同。反应最慢的细胞系是HCC1806，在该细胞系中，SREBF1基因敲除的细胞在第一周表现出脑生长缺陷，但随后呈现出与野生型细胞平行的生长轨迹。这种生长的恢复并不能用基因组编辑的逆转来解释，因为实验结束时的脑转移瘤显示了SREBF1位点的编辑证据和最低的SREBF1蛋白表达。相反，作者发现SREBF1非依赖性的生长与脂肪酸转运蛋白CD36和脂肪酸结合蛋白FABP6的上调有关。值得注意的是，HCC1806在小鼠脑切片条件培养基中的培养同样导致SCD和CD36表达上调。在SREBF1基因敲除后，JIMT1细胞没有上调CD36或FABP6的表达，这可能解释了它们无法在大脑中生存的原因。综上所述，这些结果进一步证明了脂质代谢与脑转移的关系，因为在SREBF1丢失的选择性压力下，细胞必须通过其他途径获得脂质才能在脑微环境中生存。
使用人类细胞系进行此类实验的一个限制是，它们需要使用免疫缺陷的小鼠。免疫系统在调节转移模式中的作用程度仍有待确定。作者只跟踪了MetMap发现的一小部分-特别是乳腺癌转移到大脑。多条实验和临床证据表明，脂质代谢在调节细胞在大脑微环境中生存的能力中起着重要作用。许多研究已经强调了脂质代谢在癌症中的重要性，但据作者所知，它在脑转移中的作用还没有完全被认识到。特别耐人寻味的是，干扰脂质或胆固醇代谢可能会消除大脑中的转移性生长。更广泛地说，这项工作说明了癌细胞生长和组织微环境之间复杂的相互作用。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2969-2