丙型肝炎病毒，从发现到治愈
Ralf F.W. Bartenschlager、Charles M. Rice 和 Michael J. Sofia开发了一个新的系统来研究丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV） 的复制，并且利用该系统变革了此类慢性、往往是致死性疾病的治疗。他们也因此被授予2016 年度拉斯克 · 德贝基临床医学研究奖。
肝脏是人体最大的器官，具有代谢等多种功能。多种病毒可感染肝脏，这些病毒被称为肝炎病毒，已知的有 5 种肝炎病毒，包括 HCV，它一开始被认为是导致输血后非甲非乙型肝炎的病原体。由于约 6% 的患者在输血后出现非甲非乙型肝炎，科学家作出了巨大的努力以分离并克隆出可能的滤过性病原体，例如病毒。
在 1989 年的一篇里程碑式的文献中，Houghton 及其团队首次分离出了 HCV 的分子克隆，并一睹 HCV的基因组 ：正链 RNA 病毒，基因组长度约为 9500 个核甘酸，所编码的长链多聚蛋白裂解为 8 至 10 个 产物。随后多家实验室确认，这些 HCV 蛋白中包括两种病毒酶，分别是非结构蛋白 (NS)3-4A 丝氨酸蛋白酶和NS5B RNA 依赖性 RNA 聚合酶，两者均为极具潜力的HCV 药物靶标。随后的研究开发出了新的 HCV 有效治疗药物。
药物开发的瓶颈是缺乏 HCV 细胞培养系统，但HCV 分子克隆带来了希望，这是因为正链 RNA 病毒的基因组具有传染性。将含有基因组 RNA 或等价的基因组 RNA 的质粒导入受纳细胞，就会启动一个完整的病毒生命周期。这一方法在许多其他病毒上奏效，但应用 于 HCV 时却失败了。最后，Kunitada himotohno 和 Charles M. Rice 的实验室发现了其中的原因 ：病毒基因组 3’末端缺失了一块。鉴于当时我们对 HCV 基因组已经完全了解，克隆出功能性互补 DNA（complementary DNA) 应该并不难，但如果没有细胞培养系统，如何对其进行检测？ 1997 年，反映“共有”序列的克隆被用于筛选存在于人源性 HCV 中或实验室cDNA 克隆期间获得的致死性突变。将该人工合成的裸基因组 RNA 注射至黑猩猩肝脏，随后出现了增殖性HCV 感染，并提供了首个遗传系统，这证实了可能的HCV 特异性药物靶标对于该病毒至关重要。
在已有上述具有体内传染性的 HCV 基因组 RNA后，似乎可以预期合适的细胞培养系统将很快出现，然而情况并非如此。Ralf Bartenschlager 实验室的工作解决了这一问题，其采用了从慢性感染患者肝脏克隆的另一种 HCV 共有基因组。还改造出了“选择性迷你基因组”，称为复制子（replicons），其用于分离支持稳定的HCV 复制的罕见细胞。这些复制子编码可进行自主复制及产生细胞毒性药物 G418 耐药所需要的最小病毒蛋白集合。通过药物选择，可以分离出支持 HCV 长期复制的细胞。这一首个稳定的 HCV 细胞培养模型重现了HCV 复制周期的所有细胞内步骤，并且因为这些 HCVRNA 的复制依赖于病毒酶，最引人注目的是 NS3 蛋白酶和 NS5B 聚合酶，所以该复制系统适用于开发药物。
Rice 和 Bartenschlager 随后开展的研究揭开了高效复制的原因。首先选择出细胞池中最为受纳 HCV 的单个细胞 ；其次，所选细胞克隆中的复制子含有突变，该突变可成倍地增强 HCV RNA 复制。将这些突变插入亲代复制子中，可对 HCV 复制进行直接测量。由此构建了首个广泛用于研究 HCV 生物学的遗传系统。随后Bartenschlager、Rice 等人改良了这一方法。
在已有稳定的 HCV 复制子全细胞系统后，制药和生物技术公司主要致力于 HCV 抑制剂研究，希望找到靶向抗病毒药，并最终替换当前 HCV 感染的标准治疗，即干扰素注射和利巴韦林的联合治疗，该联合治疗可能导致重度不良反应，治愈率不高，并且基因型覆盖范围有限。
2005 年，HCV 药物研发的努力集中于数种关键病毒靶标，包括 NS5B RNA 依赖性 RNA 聚合酶（NS5B RdRp）。Pharmasset 公司的 HCV 复制核苷抑制剂研究确认了一种独特的 2′ -α-F-2′ -β-C- 甲基胞苷衍生物PSI-6130（一种 HCV 抑制剂）。针对 HCV RdRp 的核苷靶向药物有望提供更为广阔的基因型覆盖范围，并防止病毒耐药性的出现。该核苷在复制系统中显示出HCV 抑制作用，相比其他病毒对 HCV 有高度选择性，显示出泛基因型特征，并且证实具有高耐药基因屏障。但是 PSI-6130 缺乏足够的口服生物利用度资料，其代谢后形成了大量非活性尿苷，因此到达靶标的活性药物有限。
经初步尝试改善 PSI-6130 后，开发出了 PSI-6130前体药物。在临床研究中，PSI-6130 前体药物验证了这一概念，即 2′ -α-F-2′ -β-C- 甲基胞苷在患者中抑制 HCV，并且是首次对非基因型 1 患者有效的直接作用抗病毒药物。但是该候选药物的局限性也很明显，需每日两次大量给药才能显示出疗效，并且非活性尿苷代谢物仍然存在。
为解决 PSI-6130 前体药物的这一不足，Sofia 及其同事对该核苷抑制剂进行了彻底的再设计。研究显示该尿苷代谢物的三磷酸盐是 HCV RdRp 的强效抑制剂，并在人原代培养肝细胞中展现出较长的半衰期。三磷酸盐半衰期越长，细胞内的活性药物浓度则越高。已经确定的是，阻断尿苷至活性三磷酸盐的代谢转化过程可引起其活性缺乏。该阻断作用特异性针对尿苷至单磷酸盐中间产物的转化过程。
为解决将高电荷、不稳定且不能透过膜的单磷酸尿苷运输至细胞，并最终进入机体的问题，提出了“特洛伊木马”策略，即通过掩蔽单磷酸尿苷达到增加稳定性并促进转运至机体和肝细胞的目的。在进入肝细胞后，该“掩蔽物”需要脱离，以暴露出单磷酸盐，之后细胞将其转化为三磷酸盐抑制剂。同时，该掩蔽物还被设计为借助肝首过效应以促进药物的肝靶向作用，即利用肝酶选择性地移除掩蔽物，并最终将该药物转移至肝细胞内。
在大量体内外临床前开发中，评价了多种经过掩蔽的单磷酸尿苷，最终选择了临床候选药物 PSI-7851。之后在一项短期研究中，PSI-7851 在接受每日一次给药的 HCV 患者中显示出高效性，并且未观察到任何药物相关不良事件或者耐药。这一结果提供了肝靶向单磷酸尿苷前体药物的概念验证。在一项名为“Electron”的里程碑式临床研究中， PSI-7977（PSI-7851 的单一同分异构）和利巴韦林联合用药 12 周在 HCV 基因型2 和 3 的患者中显示出了 100% 的治愈率（定义为治疗完成时持续病毒学应答）。这一结果为临床医生如何治疗 HCV 感染患者提供了一种新方法，医生无需再注射干扰素。PSI-7977（现称为索菲布韦）联合利巴韦林的3 期临床研究证实了高治愈率，随后索菲布韦联合利巴韦林被美国食品药品管理局批准用于 HCV 基因型 2 和3 的患者。但是索菲布韦联合利巴韦林在 HCV 基因型 1的患者中并未达到较高的治愈率。
在开发出含有选择标记和报告基因的报告复制子后，可以进行数百万化合物的高通量筛选，由此发现了一种新型、极强效的 HCV 抑制剂，即 NS5A 抑制剂。该报告复制子的开发证实了复制子系统的多功能性，并发现了缺乏酶活性的特殊药物靶标。随着 NS5A 抑制剂和下一代 NS3-4 蛋白酶抑制剂的进一步开发，现已可以开展针对索菲布韦联合用药的临床研究。之后还批准了多种基于索菲布韦的联合用药用于治疗 HCV，包括首个单片、固定剂量的索菲布韦和雷迪帕韦复方制剂，其在 HCV 基因型 1 感染患者中显示出超过 95% 的治愈率。
从确认引起肝损害的病毒到安全且高效治愈 HCV花费了 24 年。随着时间的推移，HCV 感染必定会被冠以罕见病的称号。