荷兰16个水貂养殖场新冠研究：人畜双向传播，未系统性突变
在此次新冠疫情期间，动物感染新冠病毒的事件并不罕见，但水貂在其中较为特殊。截至目前，已有丹麦、美国、意大利、荷兰、西班牙和瑞典6个国家报告貂养殖场发现新冠病毒，鉴于养殖数量的庞大，科学家正在评估水貂是否已经成为病毒的“蓄水池”，从而助推疫情传播。
近日，丹麦因全国范围内捕杀水貂引发争议而将计划暂停，但顶级学术前《科学》（Science）最新发表的一项研究提醒外界，水貂和新冠病毒之间存在着千丝万缕的关系，应谨慎而科学地对待这一问题。
当地时间11月10日，《科学》（Science）在线发表了由荷兰鹿特丹拉斯姆斯医学中心、世卫组织虫媒病毒和出血热参考和研究合作中心、荷兰食品和消费品安全局等机构的研究人员联合完成的一项研究，题为“Transmission of SARS-CoV-2 on mink farms between humans and mink and back to humans”，文章通讯作者为鹿特丹伊拉斯姆斯医学中心病毒学家Bas B. Oude Munnink。
研究团队对荷兰前16个暴发疫情的水貂养殖场进行了深入调查和分析，他们认为：SARS-CoV-2最初是由人传入养殖场，并在此后不断演变。尽管加强了生物安全并开展了预警监测，还立即扑杀了受感染的养殖场水貂，但水貂养殖场之间仍出现了传播集群，传播方式不明。
证据显示，在水貂养殖场发现SARS-CoV-2后，68%的被检测员工和/或亲属及其接触者感染了SARS-CoV-2，这表明与感染了SARS-CoV-2的水貂接触是感染病毒的一个危险因素。研究团队还全基因组测序（WGS）分析证明，不仅人将病毒传染给了水貂，水貂养殖场内也出现了病毒从动物向人的传播，也就是新冠病毒在人和水貂之间可发生双向传播。
实际上，早在5月19日，荷兰的一项调查即首次提出：该国一个水貂养殖场里的水貂将病毒传染给了一名工作人员，这也是全球首例水貂致人感染新冠。在此之前，外界普遍认为仅有人到水貂的传播链。
这项研究表明了水貂养殖场中正在发生SARS-CoV-2传播，以及到人类的溢出事件。研究团队指出，应对水貂和其他鼬科动物进行更多的研究，以了解这些物种是否有成为SARS-CoV-2宿主的风险。
研究团队强调，到目前为止，调查未能找出可能解释农场到农场传播的共同因素，有可能是通过没有被纳入检测的临时工。鉴于他们观察到其他地方的水貂养殖场也发生了SARS-CoV-2感染，当务之急是毛皮生产和交易不应成为未来SARS-CoV-2的蓄水池，将病毒溢出到人类。
SARS-CoV-2宿主尚未明确
尽管在蝙蝠和穿山甲中发现的冠状病毒与SARS-CoV-2有最大的序列一致性，但顶级学术期刊《自然-微生物学》（Nature Microbiology）在7月底发表的一项研究指出，SARS-CoV-2可能在40-70年前从与之关系最紧密的蝙蝠病毒中分化出来了，意味着产生SARS-CoV-2的病毒谱系可能已经在蝙蝠中传播几十年了。
目前的事实是，科学家尚未确定SARS-CoV-2的动物宿主。
已知的是，与SARS-CoV-1相似，SARS-CoV-2与宿主的血管紧张素转换酶2 (ACE2)受体结合。基于ACE2受体的相似性，一系列不同的动物已经被用作动物模型。实验感染已经证明，狗、猫、雪貂、仓鼠、恒河猴、树鼩、猕猴、非洲绿猴、狨猴、兔子、和果蝠这些物种都对SARS-CoV-2敏感。并且，实验感染的猫、树鼩、仓鼠和雪貂也都可能传播病毒。相反，猪和其他几种家禽感染SARS-CoV-2的实验并未成功的。
SARS-CoV-2也偶尔在自然感染的动物中被发现。此前，在美国和中国香港，有团队已经在狗身上发现SARS-CoV-2 RNA。而在法国、中国香港、比利时、西班牙和美国，通过RT-PCR对猫的SARS-CoV-2检测也显示呈阳性。
此外，美国的纽约布朗克斯动物园，5只老虎和3只狮子身上发现了SARS-CoV-2。在意大利、荷兰和中国武汉，有团队已经在猫身上发现了SARS-CoV-2抗体。
4月底在水貂中发现疫情，同时近七成相关人员被感染
相比于上述提到的这些动物宿主，水貂引发了更大的关注。
研究团队在论文中提到，早在4月23和4月25日，荷兰的两个水貂养殖场NB1和NB2首次检测出SARS-CoV-2。在这些养殖场发现SARS-CoV-2后，研究开始了深入调查，以确定潜在的传播途径，并进行环境和职业风险评估。
在这项研究中，他们通过结合SARS-CoV-2检测、全基因组测序（WGS）和深入访谈，描述了对前16个感染SARS-CoV-2的水貂养殖场（分别命名为NB1-NB16）的疫情暴发的调查结果。
论文提到，为了应对水貂养殖场的疫情，荷兰国家人畜共患疾病应对系统此前已经行动起来，尽管当时认为与SARS-CoV-2感染动物接触的公共卫生风险很低，但这仍需要各方加强意识，评估未来动物在这场COVID-19大流行中的参与作用。
因此，从2020年5月20日起，水貂养殖场主、兽医和实验室必须向荷兰食品和消费品安全协会报告水貂的症状，并建立了广泛的监测系统。
作为荷兰监测工作的一部分，迄今已有1750株来自荷兰不同地区患者的SARS-CoV-2病毒进行了全基因组测序测序。在这项研究中，研究团队结合流行病学信息、监测数据和全基因组测序对员工感染和水貂感染之间的相互作用机制进行研究，对荷兰水貂养殖场和员工的SARS-CoV-2暴发进行深入调查。
16个SARS-CoV-2阳性水貂养殖场的所有者和雇员被纳入了接触者追踪调查，并进行了检测。从4月23日，即第一个荷兰水貂养殖场的动物疫情被发现开始，截至6月26日，研究团队共记录了16个水貂养殖场的数据，统计了超过72万只水貂和97位相关人员的数据。
结果显示，在97名接受检测的相关人员中，88个上呼吸道样本中有43个（49%）经RT-PCR检测为阳性，75个（51%）血清样本中有38个（51%）检测为SARS-CoV-2特异性抗体阳性。总的来说，97人中有66人(68%)有SARS-CoV-2感染的证据。
人可传染至水貂，水貂也可传染到人
研究调查表明，最早出现疫情的养殖场中，人身上更早出现了症状。
在4月28日的询问中，NB1养殖场的5名员工中有4人报告说，在水貂中发现疫情前，他们曾出现呼吸系统症状，但没有人接受过SARS-CoV-2检测。他们最早出现症状的时间是从4月1日到5月9日。对4月28日取样的16只水貂和5月4日取样的一名员工，研究团队获得了全基因组测序结果 (hCov-19/Netherlands/NoordBrabant_177/2020)。研究团队指出，虽然两者有7个核苷酸的差异，但水貂和员工的病毒来源相同。
同样，在NB2养殖场中，SARS-CoV-2在4月25日被检测出来。回顾性分析显示，NB2 1名员工在3月31日因SARS-CoV-2住院。4月30日从8名员工身上采集的所有样本经RT-PCR检测均为阴性，但SARS-CoV-2抗体检测呈阳性。从水貂身上获得的病毒序列与NB1养殖场的不同，表明是单独引入的。
也有养殖场显示，人感染新冠病毒的时间晚于水貂，这也意味着水貂感染了人。NB3养殖场在5月7日检测出SARS-CoV-2感染，其最初所有7名员工的SARS-CoV-2检测结果均为阴性，但在出现与COVID-19相关症状后于5月19日和5月26日进行的重新检测显示，在养殖场工作或生活的7名员工中有5人的SARS-CoV-2 RNA检测呈阳性。
研究团队从这5名员工中获得全基因组测序，将这些序列与NB3养殖场中水貂提取的序列进行聚类分析，并结合最初的阴性检测结果和症状开始时间，表明该养殖场的水貂感染SARS-CoV-2后，员工随后感染了SARS-CoV-2。
研究团队通过接触追踪发现了另外一例感染：一名没有去过养殖场的员工密接者感染了在农场NB3中发现的SARS-CoV-2毒株。来自NB3养殖场的水貂和人病毒序列与来自NB1养殖场的序列很接近，都落在A簇中。
同样，在NB7养殖场中也可能发生了水貂向人类的人畜共患传播。5月31日，该农场在水貂身上发现了SARS-CoV-2感染，最初对员工的SARS-CoV-2检测呈阴性，然而随后几名员工开始出现症状。在6月10日至7月1日期间，研究人员采集了10名员工的样本，其中8人检测显示SARS-CoV-2 RNA呈阳性。研究团队获得的2名NB7养殖场员工的全基因测序显示，他们的病毒序列与来自这个农场的水貂的序列属于同一簇。
研究团队将从水貂养殖场和员工那里得到的序列与全国约1775份WGS数据库进行了比较。为了区分社区获得性感染和水貂养殖场相关SARS-CoV-2感染，并确定生活在水貂养殖场附近居民的潜在风险，研究团队还获得了和前4个暴发疫情水貂养殖场四位邮政编码相同区域的新冠感染者的全基因组测序，采样时间在3030年3月4日至4月29日。
这些本地序列显示和水貂养殖场的序列簇并不相关。研究团队认为，这表明水貂养殖场的病毒没有溢出到附近居住的人群中。
鉴于很对水貂养殖场的员工是来自波兰的季节性移民，研究团队还将水貂养殖场调查的序列与来自波兰的序列进行了比较（n= 65），但这些序列更加不同。
病毒序列分为5个不同簇，病毒在水貂种群中进化速度更快
研究还通过水貂SARS-CoV-2基因组的系统发育分析表明，16个养殖场的水貂序列分为5个不同簇。来自养殖场NB1、NB3、NB4、NB8、NB12、NB13和NB16的病毒属于簇A，养殖场NB2的序列形成了一个独特的簇B，来自养殖场NB6、NB7、NB9和NB14的病毒形成簇C，养殖场NB5、NB8、NB10和NB15的病毒形成簇D，养殖场NB11的序列被认为形成簇E，养殖场NB8的病毒显示来自簇A和簇D。
从7个不同的水貂养殖场的员工或密切接触者处总共获得的18个序列还显示，在大多数情况下，这些人的基因序列与同一农场的水貂基因序列几乎相同。但养殖场NB1的情况不同，人的序列与最近相关的水貂序列有7个核苷酸差异。养殖场NB14的情况也是如此，与最近相关的水貂序列有4个核苷酸差异。在养殖场NB8的员工中的样本与NB12的动物聚集在一起，可能是因为这两个养殖场之间有人员交换。
论文提到，在水貂养殖场NB1-NB4报告了水貂存在呼吸系统症状和死亡率上升后，即对它们进行了SARS-CoV-2检测。来自养殖场NB1的序列显示0-9个单核苷酸多态性(SNPs)差异（平均3.9个核苷酸），而来自养殖场NB2的序列显示0-8个单核苷酸多态性差异（平均3.6个），这比通常在人类暴发环境中观察到的要多。
在最初检测出SARS-CoV-2后，这些养殖场每周进行筛查。第一、第二、第五和第六周筛查都产生了新的阳性结果。
论文指出，与来自武汉的参考序列NC_045512.2比较，水貂病毒序列中出现了若干非同义突变。然而，在所有水貂样本中没有发现特定的氨基酸替代。值得注意的是，簇A、簇C、簇E有614G位点变异。
研究团队认为，基于这一阶段的数据，各簇水貂或人类的疾病表现并没有明显的差异，但对养殖场NB16之后暴发疫情的养殖场中收集和分析的数据仍需进一步调查。“我们观察到在一般人群中也能看到类似的突变，同样的突变也可以在与水貂养殖场有关的人病例中发现。”
研究团队还指出，一些水貂养殖场中观察到序列的高度多样性，这可能是由于在发现死亡率上升之前，水貂身上已发生了多代病毒感染。目前的估计是，SARS-CoV-2在人类群体中的碱基位点年替换率约为1.16*10^-3，相当于每两周发生一个突变。这可能意味着病毒已经在水貂养殖场传播了一段时间。然而，在一周前检测仍为阴性的养殖场中也观察到相对较高的序列多样性，这暗示了病毒在水貂种群中的进化速度更快。
研究团队分析，水貂养殖场动物数量庞大，生活密度高，这可能促进病毒的传播。然而，病毒引进的时间尚不清楚，因此很难对水貂养殖场的替换率得出明确的结论。
研究团队称：我们的测序没有显示任何需要评估潜在表型效应的系统性突变。据估计，人类SARS-CoV-2的代际间隔约为4-5天，但在动物数量和密度高的养殖场中，高剂量暴露可能会缩短病毒代际间隔。