子宫腺肌病在位内膜和异位病灶的单细胞转录组分析

文献标题：Single‑cell transcriptomic analysis of eutopic endometrium and ectopic lesions of adenomyosis
发表时间：2021.03.08
发表杂志：Cell & Bioscience（IF=5.026）
原文链接：https://cellandbioscience.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13578-021-00562-z

摘要

背景
子宫腺肌病（Adenomyosis，AM）作为常见的妇科慢性良性疾病，其精确的发病机理尚不清楚。单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）能够发现罕见的细胞亚群，探索其遗传学和功能的异质性，并揭示每个细胞的独特性，让我们能从更为详细和微观的方面解释生物学问题。作者利用scRNA-seq鉴定了AM中在位内膜（Eutopic endometrium，EM）和异位病灶（Ectopic lesions，EC）的基因表达模式，并探索了AM的潜在发病机制。

结果
scRNA-seq结果显示，与肿瘤、细胞运动、炎症反应、细胞增殖和血管再生等有关的生物学行为可能在AM发病进程中起到重要作用。并且，异位内膜中EPCAM和PECAM1的共定位显著增加（P<0.05）；异位病灶样本中的拷贝数变异（Copy number variation，CNV）增加，表现出肿瘤样特征；在内膜上皮细胞中，VNN1和EPCAM阳性的亚群出现活跃的细胞运动。在上皮-内皮转换（Epithelial-endothelial transition，EET）的过程中，异位病灶的血管生成拟态（Vasculogenic mimicry，VM）形成出现显著累积。

结论
作者的结果支持了AM起源自内膜侵袭和迁移的理论，并鉴定了具有高CNV和肿瘤相关特征的细胞亚群，还验证了AM中的EET和VM生成，这些过程在维持病灶细胞生长和血供中起到重要作用。作者进而推断EET和VM的抑制剂可能是AM治疗的潜在策略之一。

引言

AM是常见的慢性良心妇科疾病，其定义为子宫内膜腺体和基质在子宫肌层的异位生长，在临床上主要表现为异常子宫出血、月经过多、痛经、接触性疼痛或不孕症等。目前，针对AM的发病机制，主要有两种假说：

  1. AM起源自子宫内膜基层的内生，主要由内膜侵袭和迁移活性增强，肌层功能弱化，内膜-肌层交界处的免疫活性改变以及激素的异常释放引起。这一过程与恶性肿瘤侵袭和转移类似。
  2. AM可能与多个苗勒氏残基的胚胎学失位以及内膜干祖细胞分化有关。

然而，到目前为止，两种假说都无法解释AM的所有表型，相关证据仍有待补充。

材料与方法

scRNA-seq样本

  • 共3例样本：
    病例组：46岁，女性，AM患者，分别取其在位子宫内膜（AM_EM）和异位病灶（AM_EC）样本各1例
    对照组：50岁，女性，子宫肌瘤患者，排除子宫内膜异位症和AM，取在位内膜1例（AM_CTRL）

  • 建库测序：Chromium Single-cell 3′ Reagent V3 Kits （10x Genomics）

数据分析

  • 上游处理：Cell Ranger 3.0.0，分别完成比对定量后，使用aggr合并三个样本（我猜的，因为原文提到了“Downsampling of mapped reads was required to generate normalized aggregate data across samples”）。

  • 质控：

    从42,292个细胞过滤剩下36,781个细胞。

    1. 根据nUMI和nGene的分布特征，保留mean ± 2*SD范围内的细胞；
    2. 去除线粒体基因比例>25%的细胞；
    3. 使用Scrublet鉴定潜在的doublets，设定估计的doublet rate为10%。

  • 下游分析：Seurat 3.1.1流程，主要包括：

    1. 归一化：LogNormalize；
    2. 高可变基因（HVGs）：分别计算每个基因的平均表达量和离散程度，得到HVGs，估计应该是用selection.method="mvp"；
    3. 主成分分析（PCA）、图聚类（louvain还是leiden也没说）、t-SNE降维可视化；
    4. 差异表达分析：FindMarkers，使用likelihood ratio test方法，设定P<0.05且|log2 Fold-change|>0.58为差异表达基因；
    5. 细胞亚群注释：SingleR包，Immgen参考数据集。

  • CNV分析：使用inferCNV包，将基因根据染色体位置排序，使用大小为101个基因的窗口来决定基因表达的移动平均值，并将基因表达值按照均值中心化。选取T/NK细胞、巨噬细胞和肥大细胞作为正常细胞，剩余细胞作为恶性细胞计算CNV。

  • 拟时间分析：使用monocle 2.8.0，将counts矩阵导入为CellDataSet对象后，利用differentialGeneTest筛选排序基因（qval<0.01），再降维拟合分化轨迹。

主要结果

scRNA-seq揭示AM在位内膜和异位内膜的细胞异质性

主要是展现细胞分群和marker基因可视化。

几个免疫细胞亚群：T细胞（CD8A）、NK细胞（NKG7）、肥大细胞（CPA3）和巨噬细胞（MS4A6A）

非免疫细胞：上皮细胞（EPCAM）、内皮细胞（PECAM1）、平滑肌细胞（MYH11）和成纤维细胞（APOD）

其中，5号亚群似乎不表达以上任何一种细胞类型的marker基因，作者将其标注为Unknown。另外，Cluster1亚群同时表达包括上皮细胞和内皮细胞的marker基因，需要进一步探索。

Cluster1细胞中上皮细胞和内皮细胞标记基因存在共定位

作者发现，cluster1细胞主要出现在EC样本中，且同时表达上皮细胞标记基因EPCAM和内皮细胞标记基因PECAM1，免疫荧光实验也验证了这群细胞在EC样本中的存在。对Cluster1细胞的marker基因进行GO和KEGG分析，发现它们主要与癌症、细胞运动和炎症反应有关。

作者进一步对Cluster1细胞和正常上皮/内皮细胞进行比较，发现与血管生成、细胞运动和癌症相关的基因在Cluster1细胞中相对上调。CNV水平在Cluster1细胞中也出现增加。

比较CTRL、EM和EC样本的基因表达模式

作者分别在整个样本水平和细胞类型水平（上皮细胞和内皮细胞）比较了不同组别样本之间的转录差异。其中，与EM组相比，EC组上调表达包括MMP1、ESM1、ANGPT2和CYP1B1在内的基因。在单独对内皮细胞的比较分析中，EC组上调的基因与多种血管生成、癌症、细胞迁移、NF-κB和PI3K-Akt信号通路等有关。作者由此推断异位病灶中内皮细胞的血管生成功能增强，并可能表现出某些恶性肿瘤类似的特征。

另外，在上皮细胞的组间比较中，作者鉴定了EC组上调的基因，包括与血管生成（MMP1和ESM1）、炎性反应（ITGA2）和细胞运动（ITGA2和ITGB8）相关的基因。由于此前有报道上皮细胞的间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）和迁移能力增加在AM发病中也具有重要作用，作者随后开始重点关注上皮细胞。综合这部分结果，除了Cluster1细胞以外，AM异位病灶的上皮细胞和内皮细胞本身也发生了疾病相关的改变。

上皮细胞的不同亚群

GO和KEGG分析显示，与EM组相比，EC组上皮细胞上调表达的基因主要与细胞运动、炎症信号通路、NF-κB、IL-17和TNF信号通路有关。

作者进一步将上皮细胞分为7个亚群，发现subcluster1（绿色）在EC组的比例高于EM组，而subcluster4（黄色）则相反。subcluster1细胞主要上调与细胞迁移相关的基因（RHOD、TIAM1、VNN1和ALDH1A3），并且功能富集分析也显示subcluster1细胞主要富集与迁移、细胞骨架调节和恶性肿瘤等相关的特征。对于subcluster4细胞，其主要富集的功能包括炎症相关通路、抗原递呈等。

拟时间分析提示AM中存在上皮-内皮转化（EET）

作者将Cluster1细胞、上皮细胞和内皮细胞提取出来做拟时间分析，发现Cluster1细胞（亚群1）呈现由上皮细胞（亚群7、17）特征向内皮细胞特征（亚群2、9、10、15）分化。在拟时间轴上，marker基因也呈现出从上皮细胞（EPCAM、CDH1、KRT7）向内皮细胞（PECAM1、VWF、CDH5）的转化。作者进一步发现该轨迹的末端出现了血管生成拟态（VM）相关的基因（F2R、FLT1、KDR）上调表达。由于EET会产生内皮细胞样肿瘤细胞并促进VM形成，作者于是通过CD34-过碘酸-希夫（CD34-periodic acid-Schiff，CD34-PAS）双染色，发现EC组内膜中的EET和VM形成相较于CTRL组显著增加，而EM组和CTRL组的差异则无统计学意义。

小结

至此，作者通过scRNA-seq的结果提出了AM发病机制可能与子宫内膜的迁移、侵袭有关，且细胞增殖、炎症反应和血管生成对AM的进展有着重要作用。在异位病灶样本中发现的细胞亚群具有恶性肿瘤类似的特征，并且上皮细胞存在EET和VM生成增加的现象。基于这一最新的发现，作者进一步推断，EET和VM的抑制剂可能会成为AM治疗的潜在策略之一。

点评

这篇文章的主要亮点在于从AM异位病灶中新发现了可能与疾病进展有关的细胞亚群（Cluster1），并且在组织切片中验证了其存在。根据Cluster1同时表现出内皮细胞和上皮细胞特征，作者通过对三类细胞的重点分析揭示了EET和VM在AM进展中的作用，并同样在组织切片中加以验证，逻辑清晰，科学故事基本上是完整的。这一切都离不开作者对AM这个疾病有着深厚的背景知识积累。另外，数据分析结果的实验验证也功不可没，想想过去有多少组学数据的结果验证不出来……

说回数据分析，本文在初步聚类分群时是采用Cellranger aggr方法简单地合并样本，并没有做进一步的Integration，而在第一张t-SNE图中也能看到对照组和两个疾病组还是分得很开。由于我过去一直在做发育相关的scRNA-seq，接触的都是正常组织样本，如果本文的数据给我来做，恐怕我第一反应就是把三个样本丢到Seurat里面做整合了，然后降维聚类、鉴定共同的细胞亚群等等。由于Seurat的整合常常有overcorrection倾向，那群Cluster1细胞恐怕就会被拉到上皮和内皮细胞中，我就找不到了。这让我不由得想起伟人说过的“矛盾具有特殊性，具体问题要具体分析”。

总之，我们应该从这篇文章学习的是怎么利用scRNA-seq讲好一个生物和医学的故事。我身边很多人吐槽说，给公司送样本、测了一堆数据，但是自己又不懂生信，看着公司交出的分析报告无从下手，感觉就只能被牵着鼻子走。这篇文章中，我估计数据分析主要是公司做出来的，方法学全是套路，拟时间分析的聚类注释还在用12345，都懒得改一改……但作者对生物学逻辑的把控和引导一定很强，完全看不出“被公司牵着鼻子走”。伟人说“促使事物发展的主要因素一定是内因，外因也要通过内因才能起作用”，人菜不要怪公司，自己的专业背景先过关才是王道。

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