Ebf1缺陷的MSC能引发HSCs潜能的持续改变
今天介绍的文章发表于2020年2月的Nature Immunology。文章标题：Ebf1-deficient bone marrow stroma elicits persistent changes in HSC potential。DOI:https://doi.org/10.1038/s41590-020-0595-7 。文章利用单细胞转录组揭示了Ebf1转录因子在间充质基质细胞（MSC）与造血干细胞（HSCs）之间的相互作用及对造血稳态和造血作用至关重要。
摘要
间充质基质细胞(MSCs)与造血干细胞(HSCs)之间的相互作用对于造血的持续及其谱系分化至关重要。在此，我们探讨骨髓间充质干细胞的转录改变如何对HSCs产生持续的影响。对Cxcl12丰富的网状（CAR）细胞和PDGFRα+Sca1 +（PαS）细胞的单细胞分析显示出明显的细胞异质性，但两者都表达转录因子Ebf1。在MSC中条件性敲除Ebf1改变了MSCs的细胞组成、染色质结构和基因表达谱，包括粘附相关基因的表达减少。在功能上，基质特异性Ebf1失活导致HSCs粘附受损，并导致HSCs静息状态减少和髓系分化减少。最值得注意的是，在连续移植中，位于Ebf1缺陷造血龛的HSCs的细胞组成和染色质结构发生了变化。因此，骨髓龛的遗传改变导致HSCs的长期功能改变。
背景介绍
造血干/祖细胞造血是一个受到细胞内在机制和骨髓微环境外部信号密切调控的过程。多种非造血细胞,如间充质基质细胞(MSCs)、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞和交感神经等，形成的高度复杂和动态的(造血)龛在维持血液发育中发挥重要作用。
HSCs主要与骨髓的血管系统和间充质干细胞密切相关，而间充质干细胞是血管周围龛的重要组成部分。骨髓间充质干细胞由一个异质性的细胞群组成，可通过缺失造血和内皮标志物、粘附能力和分化为多种细胞类型(包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞和肌细胞)的能力来识别。使用报告基因和条件性靶向目的基因小鼠的研究在成年小鼠骨髓中确定基质亚群，显示出其与HSCs有物理联系。Cxcl12丰富的网状(CAR)细胞主要位于血窦附近，具有分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能力。谱系追踪实验显示CAR细胞与表达瘦素受体(LEPR)的血管周细胞存在明显的交叉重叠。CAR细胞是骨髓中趋化因子（CXCL12）和干细胞因子(stem cell factor, SCF)的主要来源，调节HSCs的自我更新和分化。另外两种类型的血管周细胞，即CD45-CD31-Lin-PDGFR+Sca1+ (PαS) 细胞和NG2+(跨膜蛋白多糖NG2阳性)细胞，主要分布在小动脉周围。PαS细胞表达龛因子，如血管生成素1和CXCL12，尽管其表达这些因子的水平远低于CAR细胞。当PαS细胞被移植到受到致死剂量辐照的小鼠体内时，可生成CAR、成骨细胞和脂肪细胞。反过来，NG2+周细胞被认为可以形成一个特殊的龛，促使造血干细胞处于静息状态；因为NG2+细胞的消失会导致造血干细胞的循环，并降低造血干细胞的长期再生活力。然而，尽管造血干细胞在骨髓中的均匀分布已有报道，但是不同的血管龛是否会对造血干细胞行为的调节具有差异性仍然存在争议。
尽管对骨髓微环境的研究比较深入，但对调控MSC生物学的转录调控机制知之甚少。成骨细胞和CAR细胞前体中转录因子成骨体的表达对骨发育和胎儿骨髓HSCs的归巢至关重要。FOXC1在CAR细胞中富集，调节Cxcl12和Scf的表达，并介导骨髓中支持HSPCs的龛的维持。早期B细胞因子(Ebf)转录因子家族成员在骨髓龛中表达，影响骨髓的稳态。特别是Ebf1, Ebf家族的首先发现的成员和B细胞发育的关键调节因子，在成骨祖细胞中也有表达，并且是脂肪细胞分化所必需的。然而，我们对Ebf1在体内的相关性以及其在骨髓微环境中作用机制的认识有限。
测序数据介绍
从小鼠分选出大约1500个PαS cells与1500个 CAR cells进行单细胞转录组测序。
数据分析情况
本研究单细胞数据的处理使用RaceID3软件进行处理
数据过滤：细胞（2%的转录本）高表达低质量的Marker基因Kcnq1ot1或者高表达与Kcnq1ot1高度相关的Gm10715,Gm42418和Gm10800(Pearson相关系数>.65)将被移除，比对到ERCC的数据也将舍弃。使用RaceID3进行聚类。
表达矩阵可以下载：All high-throughput data in this study were deposited at the Gene Expression Omnibus (GEO) under series GSE127970(CAR, PαS RNA-seq and ATAC-seq), series GSE128089(HSC RNA-seq and ATAC-seq), and series GSE128743 (single-cell RNA-seq). A web application for scRNA-seq data visualization is available at https://hematopoietic-niche-regulation-by-Ebf1.ie-freiburg.mpg.de.
主要分群情况
Cellular heterogeneity of CAR and PαS cells
野生型的条件下，CAR分成8群 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 13 and 17)，PαS分成7群(7, 8, 9, 11, 12, 14 and 18) (图1a)。与之前的研究一致， Cxcl12, Foxc1, LepR and Ebf3几乎在所有的CAR细胞中均有表达，且在PαS中具有表达(图1b 和扩展数据图1c)。多数CAR细胞的亚群均表达细胞粘附和迁移
相关的基因 (Sparc, Cxcl12, Kitl, Vcam1, Igfbp4, Igfbp5 and Ibsp)，脂肪细胞的marker基因Adipoq, LepR, Rarres2 and Cebpb以及成骨相关的基因(Cola1a2, Runx2 and Sparc) (图 1c, 扩展数据图 1b，补充图表1)。此外，还发现了CAR特异性的表达基因。如，Cluster1和Cluster6特异性的表达趋化因子和细胞外基质成分相关的基因 (Cxcl9, Cxcl10, Cxcl1, Ccl2, Ctgf and Tnc)；Cluster3表达与脂肪功能相关的基因 (Adipoq, Lpl, Gpx3 and Apoe)。Cluster5高表达抑制Cxcl12–Cxcr4 信号通路的Cxcl14基因 (图 1c)。Clsuter13与上述亚群明显不同的分子信号，上述提到的基因全部地表达，高表达Mid1, Stxbp4, Adtrp, Grk4 and Vmn2r53 (扩展数据图 1b 和补充图表1)。
所有的PαS 细胞群的所有亚群表达细胞-细胞和细胞-细胞外基质接触相关的基因（Sparc，Col1a2，Col1a1，Col1a2和Col3a1）；同时各个细胞亚群表现出特定的基因表达模式(图1c, 扩展数据图1b和补充图表1)。Cluster7表达成骨相关的标记基因Bglap，Spp1和Col5a1；而Cluster18显示出丰富的软骨相关的基因Chad，Comp和Omd特征。Cluster9表达参与细胞粘附的基因（Cd248，Cd9，Dpt，Mmp2，Fndc1和Ackr3）和细胞信号传导（Igfbp6，Ccl11，S100a10和Axl）相关的基因。单细胞转录组分析揭示了MSC高度的多样性，并鉴定出了表达细胞因子和粘附分子的特定细胞亚群，这些细胞因子和粘附分子可能是将HCS保持在适当造血龛必要条件。
Ebf1 deficiency alters MSC function in vitro
Ebf转录因子家族在造血环境中起着至关重要的作用。在CAR和PαS细胞群中检测到Ebf1的表达，而在PαS细胞某些亚群检测到了Ebf2，并在所有CAR细胞中检测到了Ebf3的转录表达(图1b）。免疫印迹分析证实了两个MSC群体中Ebf1蛋白的表达（扩展数据图1b）。因此，我们选择条件性地使CAR和PαS细胞中的Ebf1失活。为了研究Ebf1缺失是否会改变CAR和PαS细胞群体的组成和/或基因表达谱，我们将Ebf1固着小鼠（Ebf1fl/fl）与有效靶向PαS，CAR和成骨细胞的血管周围龛特异性Prx1Cre驱动程序杂交细胞，但不靶向BM中的内皮或造血细胞。来自Ebf1+/+Prx1Cre和Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的CAR和PαS细胞进行单细胞测序，基于RaceID3的聚类确定了9个特异性的细胞亚群，这些亚群在Ebf1缺失型和对照基质细胞之间有差异（图1d和扩展数据图1e，f）。CAR种群的第3、8和21亚群，PαS种群的第17和26亚群对野生型细胞显着富集（P <0.05，两尾费舍尔检验）。相反，CAR种群的第14亚群和PαS种群的第1、4和5亚群主要由Ebf1缺失型细胞组成（图1e和补充表1）。在Ebf1fl/flPrx1Cre MSC中，我们观察到了编码分泌因子（Cxcl9，Cxcl10，Ccl2，S100a8，S100a9和Igfbp3），软骨细胞（Comp和Wisp2）和脂肪细胞（Adipoq和Clu）的标记的基因表达降低增加了成骨细胞特征性因子（Bglap，Myoc和Igf2）的表达（扩展数据图1g和补充表1）。将我们的scRNA-seq数据与最近发布的总BM微环境图集进行比较31,32，发现这两个数据集存在实质性重叠（扩展数据图2a，b）。尽管Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠中CAR和PαS群体的细胞组成发生了变化，但我们并未观察到绝对细胞数或生存力的显着变化（图2d，e和扩展数据图2c）。然而，Ebf1缺乏的CAR细胞显示出循环细胞的比例有适度的增加（扩展数据，图2c）。
先前对Ebf1无效小鼠的分析显示，与野生型小鼠相比，BM中的脂肪细胞和成骨细胞数量增加。因此，我们对胫骨进行了组织形态计量学分析，结果表明，相对于对照小鼠，Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的小梁骨区域的骨密度和成骨细胞数适度增加（扩展数据图3d和补充表1）。在体外，来自Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的CAR和PαS细胞生成的成纤维细胞（cfu-Fs）的菌落形成单位少于其对照对应物，并且来自Ebf1缺失的PαS细胞的cfu-F菌落未能分化为三种间充质谱系（扩展数据图2e–g）。
为了评估基质Ebf1缺失对体外HSPC维持的影响，我们进行了长期培养起始细胞分析。野生型富含HSCs的Lin–Sca-1 + c-kit +（LSK）细胞与MS-5基质细胞（其中已使用siRNA敲除了Ebf1）的共培养表明，鹅卵石菌落数量减少了两倍相对于与对照饲养细胞的共培养，由造血祖细胞形成（图2a，b）。我们进一步检查了这些共培养物中HSPC形成c.f.u的潜力。甲基纤维素培养基中的菌落。与Ebf1耗尽的MS-5饲养细胞共培养的HSPC的c.f.u.s比与对照MS-5基质细胞共培养的HSPC少（图2c）。总之，这些数据表明Ebf1缺乏会改变MSC的细胞组成和功能活性。
Loss of HSPCs and myeloid cells in Ebf1+/+ Prx1Cre mice
CAR and NG2 + cells require Ebf1 for their function
通过流式细胞术分析龛特异性Ebf1缺失对造血细胞群体的影响表明，Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的BM细胞数量正常，但与对照小鼠相比，HSCs的数量和比例降低（图2f，g和扩展数据图3a）。HSCs数量的减少并不是由于HSPC迁移至外周血而增加的缘故。来自脾脏和外周血的化验显示两组之间的菌落数相当（扩展数据图3b）。但是，我们在Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的BM中检测到了比对照组中更多的凋亡HSCs（图2h）。细胞周期分析显示，在G0期，来自Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的HSCs比例较低，而在G1期，其比例较高，这表明BM龛位中Ebf1的丧失促进了HSCs从静止状态退出（图2i）。与对照组小鼠相比，Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的BM中的骨髓偏向性多能祖细胞（MPP3）（CD135–CD48 + CD150–LSK）和成熟的髓样细胞数量也减少，外周血中的髓样细胞发生率也较低（图2j-1和扩展数据图3c）。相反，在红系和淋巴区室中未观察到明显变化，包括在淋巴偏倚的MPP4（CD135 + CD150–LSK）祖细胞，常见的淋巴祖细胞以及B和T细胞谱系的细胞中（扩展数据图3d，e）。）。总的来说，这些结果进一步证实了Ebf1在干细胞龛中维持HSCs库和支持骨髓分化的重要性。
为了探索Ebf1在MSC的更明确亚群中的作用，我们将Ebf1fl/fl小鼠与LepRCre小鼠杂交，以在正弦曲线附近的CAR细胞中敲除Ebf1。与我们在Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠中的结果相似，相对于对照组，我们在Ebf1fl/flLepRCre小鼠中检测到更少的HSCs，而BM细胞的类型没有改变（图3a和Extended Data图4a）。此外，在Ebf1fl/flLepRCre小鼠中，BM中MPP3祖细胞和成熟髓样细胞的数量以及外周血中髓样细胞的比例降低（图3b，c和扩展数据图4b，d）。在Ebf1fl/flLepRCre小鼠中，我们还检测到了比对照组小鼠更少的常见淋巴祖细胞和B细胞（扩展数据图4c，f），这可能是由于CAR细胞数量较少（图3d，e）所致。与整个已测序的CAR细胞中较低的Prx1表达相比，整个CAR细胞中都有大量LepR表达。在Ebf1fl/flLepRCre小鼠的MPP4，T细胞或类红细胞中未检测到明显的变化（扩展数据图4b，e）。因此，CAR细胞中Ebf1的缺失会影响HSPC的维持和骨髓的分化。
为了检查Ebf1缺失对位于小动脉附近的周细胞的影响，我们用他莫昔芬诱导的NG2Cre-ER小鼠与Ebf1fl/fl小鼠杂交，该小鼠可以靶向小动脉相关的基质细胞。流式细胞仪分析显示，与对照小鼠相比，Ebf1fl/flNG2Cre-ER小鼠的BM中HSCs数量减少（图3f，g），而BM细胞的连续重铺显示形成单克隆的能力降低，表明HSCs功能受损（图3h）。但是，在其他细胞群体中未检测到显着变化（图3i，j和扩展数据图4g–i）。与LepRCre和Prx1Cre介导的Ebf1缺失相反，针对NG2的Ebf1敲除对髓系细胞的分化没无影响，这与表达NG2的基质细胞对骨髓生成的可分配性相一致。因此，HSCs的适当维护需要Ebf1在包括小动脉周细胞在内的血管周围环境中发挥功能。
Cell adhesion defects in Ebf1-deficient BM stromal cells
为了深入了解缺乏Ebf1的基质细胞（MSCs）表型的机制，我们对来自Ebf1+/+Prx1Cre和Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的FACS分选的CAR和PαS细胞进行了RNA测序。我们分别在Ebf1fl/flPrx1Cre的CAR和PαS细胞中鉴定了504和443个差异表达的基因（图4a和补充表2）。在Ebf1fl/flPrx1Cre基质细胞中显着下调的基因中，我们鉴定了许多与细胞粘附，细胞与细胞和细胞与ECM相互作用，细胞迁移，炎症反应和髓样分化相关的基因（图4b和补充表2）。为了在功能上验证Ebf1缺失的MSC中潜在的黏附缺陷，我们进行了三个实验。首先，我们对野生型小鼠的LSK细胞和Ebf1+/+Prx1Cre或Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的原代CAR和PαS细胞进行了体外粘附测定。与对照MSC相比，更少的LSK细胞能够附着于Ebf1缺乏的基质细胞（图4c）。其次，我们检查了野生型LSK细胞与野生型CAR或PαS细胞（其中已敲除基质Ebf1调控基因的组合）的粘附和迁移潜力。在CAR和PαS细胞中，编码L-选择蛋白的Sell的表达降低，导致LSK粘附和迁移减少（图4d，e）。与整联蛋白在HSCs在BM中的保留及其在与龛的相互作用中的重要作用相一致35,36，击倒Itga6或Itgb8减少了LSK的粘附，但增强了它们向CAR细胞的迁移（图4d，e ）。而且，敲除PαS细胞中的Ccl3会降低LSK与PαS细胞的粘附，但不会影响LSK的迁移能力（图4d，e）。第三，我们通过向粒细胞集落刺激因子（G-CSF）注射Ebf1+/+Prx1Cre和Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠，从而诱导HSPC从BM向周围扩散，来评估体内的黏附缺陷。确实，与对照相比，我们在Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的脾脏中检测到LSK和HSCs的数量和比例增加（图4f和图5a扩展数据）。综上所述，这些结果表明，Ebf1调节基质细胞粘附程序，这对于维持BM中HSCs的功能库是必需的。
为了确定哪些被调控的基因是潜在的Ebf1靶标，我们使用了ATAC-seq（通过深度测序进行转座酶可及的染色质测定），并结合了Ebf1结合位点的数字足迹，以替代Ebf1 ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序） ），这需要大量的细胞量。我们在CAR细胞中鉴定出3926个野生型特异性和6558个敲除特异性ATAC峰，在PαS细胞中鉴定出1655个野生型特异性相对于4,841个敲除特异性ATAC峰，主要位于顺式调控元件和启动子附近（图4g）和扩展数据图5b，c）。在CAR和PαS细胞中，分别在33.2％和46.6％的野生型特异性靶标中检测到Ebf基序（扩展数据图5d）。研究表明，Ebf1的丧失会导致原B细胞中染色质的可及性降低。通过将每个包含Ebf基序的ATAC-seq峰分配给在该峰100 kb之内具有转录起始位点的基因，我们确定了潜在的Ebf1靶基因（补充表3）。我们还将Ebf1基序相关的ATAC峰与RNA-seq数据重叠，发现Ebf1基因敲除组与野生型CAR细胞相比，有29个基因（504个基因中）受到差异调节，而这29个基因包含野生型与Ebf1相关的特定ATAC峰。在PαS细胞中，443个失调基因中有12个在Ebf1基序附近显示出染色质可及性发生了改变（扩展数据图5e）。
为了进一步完善Ebf1调控基因的清单，我们在Ebf1+/+和Ebf1-/-细胞中进行了与Ebf1龛相关的ATAC位点的数字足迹分析，以评估Ebf1的占有率。我们在CAR细胞中鉴定了1,360种野生型特异性，鉴定出380个常见和591个敲除特异性Ebf足迹，在PαS细胞中发现了相似的数量（扩展数据图5f）。通过将野生型特异性数字Ebf1足迹与RNA-seq数据集重叠，我们在CAR细胞中鉴定了14个基因，在PαS细胞中鉴定了9个基因，这些基因被解除调节并且失去了Ebf1的占有率和染色质可及性（扩展数据，图5e）。在CAR和PαS细胞中，鉴定出的基因包括S100a8，Itgal，Lef1，Ccr7，Megf10和Il1b（图4h，扩展数据图5e和补充表3）。因此，涉及细胞粘附和趋化性的基因，属于CAR和PαS细胞中差异表达基因，同时可以被Ebf1调节。
Reduced self-renewal of HSCs from Ebf1fl/fl Prx1Cre mice
为了评估Ebf1缺失的造血龛中HSCs是否在功能上存在缺陷，我们在体外进行了体外克隆分析。实际上，从Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠分选出的HSCs的减少。与对照HSCs相比，其克隆形成减少（图5a）。此外，来自Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的BM细胞显示形成克隆形成的能力降低。连续重铺实验中的克隆形成（图5b）。我们还检查了Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的HSCs在体外产生髓样和淋巴系细胞的能力。为此，我们从Ebf1+/+Prx1Cre和Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠中分选了单个HSCs，并在甲基纤维素或含有髓样和淋巴样细胞因子的液体培养基中进行了培养。相对于对照小鼠的HSCs，从Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的单个HSCs产生克隆减少（图5c）。在来自Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的单HSCs液体培养基中，我们还获得了较少的髓样细胞，但淋巴细胞或巨核细胞的比例相似（图5d）。
为了确认体内HSCs的这种功能缺陷，我们将来自Ebf1fl/flPrx1Cre或对照小鼠的150个纯化的HSCs和骨髓细胞竞争性移植到了原发性和继发性野生型受体中。这些HSCs是遗传上的野生型，但已经暴露于缺乏Ebf1的龛中。因此，我们可以检测这些暴露在缺失型的HSCs移植到野生型龛中放置是否可以恢复它们的表型。对于来自Ebf1fl/flPrx1Cre和对照小鼠的HSCs，总体嵌合和供体对主要受体的BM和外周血中的HSCs，B细胞和T细胞的贡献相似（图5e，f和扩展数据图6a-d）。但是，与对照小鼠相比，移植后第8周和第16周时，骨髓中的供体对骨髓细胞的贡献减少（图5f）,同时外周血减少（图6b的扩展数据）。在二次移植中，该表型变得越来越严重，为此，我们观察到多系植入缺陷，其中BM和外周血的嵌合减少（图5g和Extended Data图6a），而供体对HSCs和成熟血的贡献减少细胞与对照小鼠相比（图5h和扩展数据图6b–d）。该移植表型可能是造血祖细胞更快耗尽的结果，这是由于Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠中HSCs增殖增加所致。实际上，与对照小鼠相比，来自原代受体的祖细胞隔室的细胞周期分析显示出增强的增殖潜能（图5i）。为了评估HSCs的潜在衰竭，我们用氟尿嘧啶（5-FU）对小鼠进行了慢性骨髓消融。与5-FU处理的对照组相比，我们观察到5-FU处理的Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠的死亡率增加（图5j）。这些结果表明，与对照相比，暴露于Ebf1缺陷位的HSCs表现出的再生能力降低和生成髓样细胞的能力降低，甚至在将HSCs重新引入野生型BM微环境后仍然存在。
Ebf1-deficient niche affects the cellular composition of HSCs
对分选的LSK祖细胞(HSCs，CD135–CD48–CD150+)进行单细胞测序:
获得6个主要的亚群 (图7a)；与野生型相比，KO小鼠表现为：Cluster2更多细胞，Cluster3更少细胞(图7b-d)。
进一步分析发现，Cluster3富集了HSCs静息状态相关的marker基因(图7e,f,扩展数据图 8a). Procr是long-termHSCs标记；同时，HSPCs高表达调控HSCs的更新相关的基因Hlf,Ash1l,Egr1,Malat1and Neat1。
Cdk6调控周期进程并且是HSCs激活的标记(富集在Cluster2)；
Cluster2与Cluster3差异表达的基因的染色体可及性是降低的(图7g，扩展数据图8b)。
临床意义
基质细胞在造血中的重要性已得到充分证实。大多数旨在了解其潜在机制的研究工作都集中在小微环境分泌的因子以及外分泌调节HSCs维持的因子。相反，控制MSC生物学的转录网络在很大程度上仍然难以捉摸。转录因子Ebf家族成员参与了MSC的生物学功能。我们发现Ebf1在CAR和PαS细胞中均表达，而Ebf2在PαS细胞的某些亚群中表达，并且Ebf3在CAR细胞中特异性表达。Ebf基因间质缺失表型的比较显示其具有独特的、部分重复的功能。特别是，Ebf3fl/flPrx1 Cre 小鼠的骨小梁质量显著增加，同时伴有骨髓腔的丢失，而与Ebf1的同时缺失导致上述情况加重。 Ebf3缺陷的小鼠成骨细胞分化增强导致进行性骨硬化，难以解决严重的造血功能缺陷。通过使用三种不同的间质删除Ebf1的小鼠模型，我们一致性发现，在二次移植中，造血干细胞数量减少和功能受到抑制。
缺乏Ebf1的CAR和PαS细胞的bulk转录组和单细胞转录组分析显示，编码调节细胞黏附和迁移成分的多个基因表达的降低。通过将转录组数据集与来自ATAC-seq的数据和数字足迹分析综合，我们发现了**Ebf1直接调控的基因，其中包括几个已知的整合素和趋化因子基因，它们介导粘附和干细胞龛的相互作用。**对于这些基因中的几个，包括整合素，我们可以在功能上验证其在体外和体内支持LSK粘附的作用。**整合素信号在维持造血干细胞或祖细胞中发挥重要作用，但目前尚不清楚激活整合素的Cxcl12-Cxcr4信号是如何介导干细胞静息状态。**造血干细胞与其微环境的相互作用对确保造血干细胞池的完整性也至关重要。这可能导致HSCs数量减少，甚至耗竭。此外，造血祖细胞与特定基质细胞之间的相互作用对造血细胞谱系启动也很重要。因此，在Ebf1fl/flPrx1Cre小鼠中基质细胞组成的变化可能导致了髓系输出的减少。
最值得注意的是，我们的数据表明，来自Ebf1缺陷造血龛的HSCs失去了自我更新能力和骨髓谱系分化能力，即使在转移到正常的（野生型）造血龛之后，也会“记住”这种表型。伴随而来的染色质可及性和/或HSCs异质性的改变可以解释这种表型，并使人联想到龛诱导的造血干细胞重编程的概念。这个概念在临床上也很重要。骨髓移植后供者来源的血液疾病病例可能是受体造血龛位功能失调的结果，这最终将永久性地改变已移植的健康的HSCs。因此，进一步研究改变骨髓间质干细胞对HSCs功能和组成的影响机制具有重要意义。
由于作者在文章中并完全没有按照图片或者图片中的顺序出现，所以我就把补充材料放在了最后。
补充材料：
扩展数据图
扩展数据图2
扩展数据图3
扩展数据图4
扩展数据图5
扩展数据图6
扩展数据图7
扩展数据图8