单细胞助力分析靶向治疗药物性超敏反应综合征
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摘 要
药物诱导的过敏综合征/药物反应与嗜酸性粒细胞增多症和全身症状(DiHS/DRESS)是一种潜在的致命的多器官炎症性疾病，与疱疹病毒活化和随后发生的自身免疫性疾病相关。病理生理学仍然是难以捉摸的,治疗的选择也是有限的。皮质类固醇治疗难以治愈的相关病例构成了临床挑战，约30%的DiHS/DRESS患者出现并发症，包括感染、炎症和自身免疫性疾病。单细胞RNA测序(scRNA-seq)的进展以前所未有的分辨率为解剖人类疾病病理生理学提供了机会，特别是在缺乏动物模型的疾病中，如DiHS/DRESS。研究者对一名难治DiHS/DRESS患者的皮肤和血液进行了scRNA-seq，确定JAK-STAT信号通路为潜在靶点。进一步表明,中央记忆CD4 + T细胞富含人类疱疹病毒6 b的DNA。通过tofacitinib进行干预可以控制疾病，并减少其他免疫抑制剂的用量。Tofacitinib以及抗病毒药物,抑制体外culprit-induced T细胞增殖,进一步支持的角色JAK - STAT通路和疱疹病毒介导药物不良反应。对难治性DiHS/DRESS患者，scRNA-seq分析成功指导的干预治疗。scRNA-seq可以提高我们对复杂人类疾病病理生理学的认识，并为个体化医疗提供另一种途径。
样品
一例44岁男性患者因服用磺胺甲恶唑(SMX)和甲氧苄氨嘧啶(TMP)引起的DiHS/DRESS。
患者有严重的皮疹和全身症状，虽然高剂量强的prednisone，但无法控制。逐渐变少量的prednisone却导致严重的耀斑并发展为毒性表皮坏死样表现(图1a)，对此给予一剂依那西普和高剂量静脉注射免疫球蛋白也没有明显改善。皮肤表现逐渐演变为弥漫性的、类似银屑病的过程，最终导致在全身性剥脱性皮炎中(图1a)。
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五名健康志愿者(HV)皮肤活检作为对照。
1.一名病人和5名志愿者的皮肤活检组织
2.同这例病人的外周血(PBMCs )
数据分析
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皮肤组织的单细胞分析
在进行无监督聚类和 t-SNEt分析(图1b和扩展数据图1a)之后，通过已确定的marker(图1c和扩展数据图1b)给细胞分群，这表明成功捕获了主要的皮肤细胞子集。在比较病人来源的细胞和HCV来源的细胞时，发现DiHS/DRESS皮肤中角化细胞和免疫细胞的相对丰度(扩展数据图1c)反映了炎症状态。
差异表达基因(DEGs)数目的投影显示免疫细胞和非免疫细胞类型发生广泛的转录组改变，其中在淋巴细胞簇中最显著(图1d)。
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为了了解淋巴细胞簇内转录变化的生物学意义，我们使用非监督聚类分析得到的DEGs进行途径富集分析。我们发现淋巴细胞激活和细胞因子信号通路的富集，部分是由IL2RG、JAK3和STAT1的上调驱动的(图1e、f和补充表1)。
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IL2RG编码共同γ链的细胞因子受体,其对淋巴细胞内稳态的关键功能,由JAK和STAT分子介导的信号和直接与共同γ链作用。参与细胞增殖(如MKI67)和迁移(如CCR10)的基因也被上调(图1e,f)，而潜在靶细胞因子的转录则未被检测到。淋巴细胞亚聚类分析导致DiHS/DRESS和HV簇的分离，表现出明显的转录组差异，进一步验证了上述基因表达在DiHS/DRESS簇中富集(图1g和扩展数据图1h)。
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血液的单细胞分析
细胞分群
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将DEGs的数量投射到t-SNE图上，发现CD4+和CD8+淋巴细胞亚群具有显著的转录组改变(图2b)，这是皮肤中观察到的具有增殖基因特征的DiHS/DRESS的特征(图2c和扩展数据图2c,d)。单细胞T细胞受体(single -cell T cell receptor, TCR)测序能够在单个T细胞水平上对配对的TCR链序列进行分析，其结果显示DiHS/DRESS T细胞中TCR的使用存在显著差异(扩展数据图2e,f)，考虑到DiHS/DRESS是由特定药物诱导的，这是一个反直觉的发现。然而，这一发现表明克隆TCR重组的结果为阴性，从而排除了T细胞淋巴瘤等淋巴增生性疾病
流式验证皮肤的单细胞分析观察的特征
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无监督分析显示，PBMC T细胞亚群中存在大量GEG，其特征是CCR4和CCR10的高表达，这些DEG具有作为皮肤归巢化因子受体的功能，而CCR7的低表达使循环T细胞得以迁移(图2c和扩展数据图2d)。流式细胞分选证实DiHS/DRESS血中CCR4+CCR10+ T细胞增加(图2d)。CCR4+CCR10+ T细胞主要是CD45RO+CCR7 -，因此是中心记忆(TCM)和效应记忆(TEM)表型(图2e)，与CCR4high CCR10 high CCR7 low 有着大量DEGs亚群 (图2b,c)相对应。
CCR4+CCR10 - T细胞分别用TCM和双阴性T细胞进行富集(图2e)。Monocle轨迹分析显示，与CCR7-表达的原CD4+ T细胞群相比，CCR4和CCR10-表达的CD4+ T细胞群分布到较晚的时间(扩展数据图2g,h)。
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进一步比较具有高转录组改变的簇(图2b)，发现细胞因子介导的信号和T细胞激活的通路上调(扩展数据图2i)，表达JAK3和STAT1的T细胞频率增加(图2f)。
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在人类疱疹病毒(HHVs)中，HHV6b的再活化被报在DiHS/DRESS报道最多。研究者推测难治性炎症可能反映了疱疹病毒的持续再活化。使用患者PBMCs进行定量PCR检测来自HHV6b的DNA(图2g)。
我们根据记忆表型对T细胞进行了分类，发现来自HHV6b的DNA在CD4+ T CM 中高度富集(图2h)。
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药物服用后的数据分析
研究者的数据指出了几个潜在的治疗靶点:(1)细胞增殖途径，(2)趋化因子受体，(3)HHV6b和(4)JAK-STAT途径。抑制淋巴细胞增殖的MMF已经不能解决皮肤炎症。使用抗ccr4单克隆抗体mogamulizumab治疗的患者出现Stevens-Johnson综合征/中毒性表皮坏死松解症，使其成为不太可行的选择。虽然在HHV6b感染中使用的是膦甲酸、西多福韦和更昔洛韦，但这些药物都没有选择性地靶向HHV6b，考虑到环孢素引起的潜在肾脏功能障碍，这两种药物都与肾毒性有关。因此，JAK抑制是唯一可行的选择。在获得知情同意后，患者开始服用jak1和JAK3抑制剂托法替尼(tofacitinib)，剂量为5 mg d−1，并在确认无毒性后将剂量增加到10 mg d−1(图3a)。
图 3
开始治疗2周后，流式细胞术检测PBMCs，发现CCR4+CCR10+CD4+和CD8+ T细胞显著减少(图3b和扩展数据图3)。
图 3
一致地，通过scRNA-seq对治疗前和治疗后PBMCs的比较发现，具有增殖基因特征的表达CCR4-和CCR10的T细胞数量减少(图3c-e)。
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值得注意的是，此治疗消除了残留的皮肤炎症，并最终使强的prednisone减少到替代剂量，停用了MMF和环孢素(图3a)。环孢素的逐渐减少和停用改善了肾功能并控制了血压。中性粒细胞计数最初下降，但停药后恢复
当HHV6b DNA水平短暂升高时(图3f)，患者的皮肤仍然保持透明，这表明疾病的控制是由于 tofacitinib. 在scRNA-seq分析时单核细胞的减少(图3d)是短暂的，不太可能与tofacitinib直接相关。
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实验数据分析
研究者们分析的慢性阶段可能并不反映早期的DiHS/DRESS事件。为了模拟罪魁祸首药物诱导的免疫反应，我们使用了淋巴细胞转化试验(LTT)，它可以可靠地测量药物诱导的T细胞的增殖
DiHS/DRESS8中含有致罪犯的毒品。羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的DiHS/DRESS CD4+ T细胞与SMX-TMP一起培养，以剂量依赖的方式增殖，形成的细胞聚集物很容易被显微镜识别(图4a)。
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第4天通过scRNA-seq分析比较有无SMX-TMP的培养，以捕获细胞增殖前的转录组改变(图4b和扩展数据图4a)，结果显示CCR7lowCCR10highCD4+ T细胞簇和单核细胞中存在大量DEGs(图4c)。MKI67表达鉴定CCR10hiCD4+ T细胞为增殖基因特征的主要亚群(Cluster 1;图4 c, d)。此外，该CD4+ T细胞簇显示了STAT1和JAK-STAT信号通路下游的其他基因的增加，包括CISH和SOCS3(参考文献29)，表明该簇中smx - tmp诱导了该通路的激活(扩展数据图4b,c)。IL13，一个潜在的靶细胞因子，也被上调(扩展数据图4c)。SMX-TMP触发了CCR4的配体CCL17和CCL22的上调，以及在单核细胞中编码主要组织相容性复合体(MHC) II类的基因，这表明T细胞募集和随后的抗原呈递是由单核细胞在接触罪魁祸首药物后介导的(扩展数据图4d,e)。
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在LTT制剂中添加完全阻断HLA-DR的抗体抑制CD4+ T细胞增殖(图4e)。
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为了确定JAK抑制是否能够抑制smx - tmp诱导的T细胞增殖，研究者使用tofacitinib进行LTT。引人注目的是，所有检测的托法替尼浓度完全抑制CD4+ T细胞增殖(图4f)和JAK-STAT通路相关基因(扩展数据图4g-j)。为了测试靶向病毒是否会对T细胞增殖产生影响，在LTT中对更昔洛韦和青蒿琥酯进行了测试。青蒿琥酯是一种具有抗hhv6活性的抗疟药。更昔洛韦和青蒿琥酯以剂量依赖性方式有效抑制smx - tmp诱导的CD4+ T细胞增殖(图4f)。
Data availability
GSE132802