差异分析及功能注释（下）
作者 | 单细胞天地小编 刘小泽
课程链接在：http://jm.grazy.cn/index/mulitcourse/detail.html?cid=55
这次会介绍如何进行差异分析及功能注释，以及比较不同分组。对应视频第三单元9-11讲
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差异分析及功能注释（上）
3 差异基因功能注释
差异基因得到的方法有很多，例如DESeq2、EdgeR、Wilcox、SCDE等等，真正有意义的差异基因，即使使用不同的方法，最后结果也不会相差太多
有了差异基因，然后就是去注释
3.1 先对monocle的结果进行注释
1rm(list=ls())
2options(stringsAsFactors = F)
3library(clusterProfiler)
4
5load(file = 'step3.1-DEG-monocle_summary.Rdata')
得到差异基因名
1de_genes <- subset(de_clusters, qval<0.05)
2> length(de_genes$genes)
3[1] 4435
然后基因ID转换
1entrez_genes <- bitr(de_genes$genes, fromType="SYMBOL",
2 toType="ENTREZID",
3 OrgDb="org.Mm.eg.db")
作者剔除掉一个基因名
1entrez_genes <- entrez_genes[!entrez_genes$ENTREZID %in% "101055843",]
2> length(entrez_genes$SYMBOL)
3[1] 4281
因为有一些de_genes的SYMBOL没有对应的ENTREZID，因此看到少了100多个基因。
然后，把存在ENTREZID的那些基因的基因名和cluster信息提取出来
1de_gene_clusters <- de_genes[de_genes$genes %in% entrez_genes$SYMBOL,
2 c("genes", "cluster")]
3# 保持de_gene_clusters$genes的顺序不变，将他的symbol变成entrez ID
4de_gene_clusters <- data.frame(
5 ENTREZID=entrez_genes$ENTREZID[entrez_genes$SYMBOL %in% de_gene_clusters$genes],
6 cluster=de_gene_clusters$cluster
7)
将差异基因对应到每个cluster
也就是拆分成4个cluster组成的列表
1list_de_gene_clusters <- split(de_gene_clusters$ENTREZID,
2 de_gene_clusters$cluster)
然后可以将4个cluster同时进行GO注释，并且放在一起（耗时！）
1formula_res <- compareCluster(
2 ENTREZID~cluster,
3 data=de_gene_clusters,
4 fun="enrichGO",
5 OrgDb="org.Mm.eg.db",
6 ont = "BP",
7 pAdjustMethod = "BH",
8 pvalueCutoff = 0.01,
9 qvalueCutoff = 0.05
10)
11# org.Mm.eg.db更新于2019年4月
12
13# 可视化
14pdf('DEG_GO_each_cluster.pdf',width = 11,height = 6)
15dotplot(formula_res, showCategory=5)
16dev.off()
简化GO注释结果
The simplified version of enriched result is more clear and give us a more comprehensive view of the whole story
https://guangchuangyu.github.io/2015/10/use-simplify-to-remove-redundancy-of-enriched-go-terms/
1start_time <- Sys.time()
2lineage1_ego <- simplify(
3 formula_res,
4 cutoff=0.5,
5 by="p.adjust",
6 select_fun=min
7)
8end_time <- Sys.time()
9(end_time - start_time)
10# Time difference of 1.588762 mins
11
12pdf('DEG_GO_each_cluster_simplified.pdf',width = 11,height = 6)
13dotplot(lineage1_ego, showCategory=5)
14dev.off()
保存结果
1write.csv(formula_res@compareClusterResult,
2 file="DEG_GO_each_cluster.csv")
3# 简化版本
4write.csv(lineage1_ego@compareClusterResult,
5 file="DEG_GO_each_cluster_simplified.csv")
这几个数字需要好好了解一下
看第一行：背景基因是20000多个，其中属于这个GO通路的有256个基因；然后C1这个cluster这里总共得到的差异基因是1236个，其中属于这个GO通路的是66个
4 以第一个GO:0140014为例，进行探索
首先获得GO:0140014中的基因 =》 256个
1library(org.Mm.eg.db)
2# 结果有3百多万个
3go2gene <- toTable(org.Mm.egGO2ALLEGS)
其实看到里面的基因ID存在重复，一个go_id会对应多个同样的gene_id，那么就要去重复，获取unique gene id
1uni_gene <- unique(go2gene$gene_id[go2gene$go_id == 'GO:0140014'])
2> length(uni_gene)
3[1] 256
结果和👆的BgRatio中记录的一致
然后拿到第一群的差异基因 =》 1284个
1c1_genes <- list_de_gene_clusters[['C1']]
2> length(c1_genes)
3[1] 1284
这里的1284比之前的1236多个几十个，说明存在几十个基因没有GO注释
找Cluster1在GO:0140014中的基因 =》 66个
其实就是找c1_genes和go2gene的交叉
1overlap_genes <- intersect(c1_genes,uni_gene)
2> length(overlap_genes)
3[1] 66
也就是对应上面GO通路的66个基因
5 差异分析结果画热图
Monocle的结果会用到上一篇的 1.6 用包装好的pheatmap画热图 的代码
ROST的结果进行差异分析
导入数据
1rm(list = ls())
2options(warn=-1)
3options(stringsAsFactors = F)
4source("../analysis_functions.R")
5
6# 加载RPKM表达矩阵
7load('../female_rpkm.Rdata')
8# 加载ROTS 的差异分析结果
9load('DEG-ROTS_summary.Rdata')
10head(summary_pop1)
11head(summary_pop2)
12head(summary_pop3)
13head(summary_pop4)
14
15# 6个发育时期获取
16head(colnames(females))
17female_stages <- sapply(strsplit(colnames(females), "_"), `[`, 1)
18names(females) <- colnames(females)
19table(female_stages)
20# 4个cluster获取
21cluster <- read.csv('female_clustering.csv')
22female_clustering=cluster[,2];names(female_clustering)=cluster[,1]
23table(female_clustering)
24
25RPKM.full=females
每个群挑选各自的top18的差异基因绘制热图
1population_subset<-c(rownames(summary_pop1[summary_pop1$ROTS.statistic<0,])[1:18],
2 rownames(summary_pop2[summary_pop2$ROTS.statistic<0,])[1:18],
3 rownames(summary_pop3[summary_pop3$ROTS.statistic<0,])[1:18],
4 rownames(summary_pop4[summary_pop4$ROTS.statistic<0,])[1:18])
总共得到了72个基因，然后取出
1RPKM_heatmap<-RPKM.full[population_subset,]
将小表达矩阵的列名重新按照4个cluster排序，并且log转换
1RPKM_heatmap<-RPKM_heatmap[,order(female_clustering)]
2RPKM_heatmap<-log2(RPKM_heatmap+1)
每个群赋予不同颜色
1popul.col<-sort(female_clustering);table(popul.col)
2popul.col<-replace(popul.col, popul.col=='C1',"#1C86EE" )
3popul.col<-replace(popul.col, popul.col=='C2',"#00EE00" )
4popul.col<-replace(popul.col, popul.col=='C3',"#FF9912" )
5popul.col<-replace(popul.col, popul.col=='C4',"#FF3E96" )
画图
1library(gplots)
2png("ROST-DEG-heatmap.png")
3heatmap.2(as.matrix(RPKM_heatmap),
4 ColSideColors = as.character(popul.col), tracecol = NA,
5 dendrogram = "none",col=bluered, labCol = FALSE,
6 scale="none", key = TRUE, symkey = F, symm=F, key.xlab = "",
7 key.ylab = "", density.info = "density",
8 key.title = "log2(RPKM+1)", keysize = 1.2, denscol="black", Colv=FALSE)
9dev.off()
6 两种差异分析方法结果比较
首先还是加载它们的结果
1rm(list=ls())
2options(stringsAsFactors = F)
3
4load(file = 'DEG-monocle_summary.Rdata')
5load(file = 'DEG-ROTS_summary.Rdata')
6
7# monocle差异基因
8mnc_DEG <- subset(de_clusters, qval<0.05)
9# ROTS差异基因
10head(summary_pop1)
11head(summary_pop2)
12head(summary_pop3)
13head(summary_pop4)
对第一群比较
1g1=rownames(summary_pop1[summary_pop1$FDR>0.05,])
2g2=rownames(mnc_DEG[mnc_DEG$cluster=='C1',])
3> length(intersect(g1,g2));length(g1);length(g2)
4[1] 194
5[1] 7006
6[1] 1319
看到ROTS得到了7006个差异基因，monocle得到1319个，它们共有194个。就数字来讲，ROTS挑选的有些”粗糙“，一般差异基因都不会挑选太多
1## 对第二群比较
2g1=rownames(summary_pop2[summary_pop2$FDR>0.05,])
3g2=rownames(mnc_DEG[mnc_DEG$cluster=='C2',])
4> length(intersect(g1,g2));length(g1);length(g2)
5[1] 620
6[1] 7015
7[1] 1100
8# 第二群，二者的重叠度较高
9
10## 对第三群比较
11g1=rownames(summary_pop3[summary_pop3$FDR>0.05,])
12g2=rownames(mnc_DEG[mnc_DEG$cluster=='C3',])
13> length(intersect(g1,g2));length(g1);length(g2)
14[1] 205
15[1] 7909
16[1] 1129
17
18## 对第四群比较
19g1=rownames(summary_pop2[summary_pop2$FDR>0.05,])
20g2=rownames(mnc_DEG[mnc_DEG$cluster=='C2',])
21> length(intersect(g1,g2));length(g1);length(g2)
22[1] 620
23[1] 7015
24[1] 1100