多通道、低成本、灵活的即时检测，哈佛大学Wyss研究所开发出新型电化学诊断技术

在当前阶段，想要对诸如败血症、心肌梗塞（MI）和外伤性脑损伤（TBI）等多种疾病进行精准诊断，需要对多种与该疾病相关的生物标志物水平进行检测并综合分析结果，才能够建立明确的诊断依据。仅有其中一项标志物的水平检测数据通常不足以作为诊断疾病的充分指标。
而在非临床实验室的即时诊断（POC）环境中，分析检测工作通常由卫生保健工作者甚至是非专业人士负责执行。这就要求即时诊断测试设备具备简单、强大和多通道的特点，可以实现多种生物标志物的检测，并可以快速获得结果。
不过，“这种诊断设备尚未用于临床或家庭环境中，现实世界中的 POC 测试设备不仅要非常可靠，而且还需要能够以低成本的方式制造。” 来自 Wyss 研究所 eRapid 团队的博士后研究员，Sanjay Timilsina 博士解释说。
近年来，为了应对新冠疫情期间对于即时诊断技术的需要，Wyss 研究所创始董事 Donald Ingber 博士及该机构旗下由高级研究员 Pawan Jolly 博士领导的传感器团队，开发出 eRapid 电化学传感平台。目前，该设备已经应用于各类难测疾病的诊断开发进程中。
（来源：Wyss 研究所）
与传统的酶免法、ELISA 等检测方法相比，这种多通路的电化学传感平台具备低成本、多组分同时检测、灵活操作等优势。
eRapid 项目由哈佛大学 Wyss 研究所、国防部研究计划局 (DARPA)、KeepSmilin4Abbie 基金会以及魁北克研究基金会的博士后奖学金资助。

开发多通道响应的即时诊断设备

原则上来说，能够检测某一特定生物分子的电化学传感器，在技术上同样可以实现多通道即时诊断功能。目前，电化学传感器常用于有毒气体、氧气和其他气体分子的检测。常见的设备即呼吸分析仪、呼出二氧化碳传感器和一氧化碳传感器等等。
在该类设备中，当气体到达传感器的工作电极时，就会在其上发生化学氧化或还原反应。这会导致从参比电极向工作电极方向上产生可检测的电流，电流强度则与被测的气体浓度成正比。
不过，目前临床中仅有极少种类的生物标志物能够使用电化学传感方法进行检测，其原因主要包括两方面：
首先，来自体液中的细胞、蛋白质和其他生物分子等 “生物污染” 会粘附在传感器表面，降低设备的灵敏度。这些生物污染不仅会阻碍电子流动，产生背景电流或电子噪声；还将阻碍待测生物标志物检测试剂与目标相结合。因此，生物污染一直是开发电化学诊断传感器的主要挑战。
此前，家用血糖仪是较少可以使用电化学传感器作为检测设备的例子。葡萄糖在血液中含量很高，通过简单的酶反应即可检测。同时葡萄糖还是一种小分子，可以顺利通过覆盖电极的半透膜 —— 该膜用于防止较大的污染物分子接触电极。不过，大多数生物标志物为各类蛋白质，尺寸较大，无法使用该方法进行测量。
其次，对于开发同时检测多种生物标志物的电化学传感器来讲，也缺乏合适的特异性生物受体。通常来说，检测某一标志物需要成对结合的亲和试剂。而在针对多个化合物并行检测时，如何避免与相似、或相近的其它试剂结合成为了主要挑战。

生物污染问题如何解决

为保护电化学传感器免受来自血液和其他体液中各种生物污染物的影响，来自 Wyss 的研究团队开发了一种基于纳米技术的防污涂层 —— 这也是 eRapid 平台的基础。
根据发表于 Nature Nanotechnology 的论文内容，防污涂层在传感器表面形成三维多孔结构，搭建起包含纳米金纤维或纳米金颗粒在内的导电纳米材料网络。
（来源：Nature Nanotechnology）
这种导电网络既能促进离子通过纳米孔流向电极表面，同时还将排斥生物污染物。其排斥原理一方面是由于其密集的小孔结构，另一方面则是网络中交联的牛血清白蛋白（BSA）分子排斥血液中的高浓度白蛋白。
作为原理证明，该团队设计了一种用于检测白细胞介素 - 6（IL-6）的生物传感器，其可以灵敏地检测未处理血清 / 血浆中的该化合物。与之相比，基于传统的聚乙二醇自组装涂层（PEG-SAM）构建的传感器仅能检测到磷酸缓冲液（PBS）中的 IL-6，在成分复杂的血浆中便一无所获。
重要的是，这种初代纳米金材料的涂层电极具有短暂的可重复性，其保存期限通常取决于搭载抗体的稳定性。在该次实验中，将使用过后的电极储存在 4℃条件下 1% 的 BSA 中，经过清洗，在使用后一个月仍保持约 90% 的电化学传感性能（检测电流密度）。与之相比，其他类型的防污涂层往往在几个小时内就失去了保护作用。
（来源：Nature Nanotechnology）
“这种防污技术将改变游戏规则，因为它可以为诊断用电化学传感器创建有效的防污表面。并且，其标志着跨工程、材料、分子生物学和医学等不同领域的多学科旅程的开始。” Ingber 表示，该技术将普遍适用于基于电化学传感技术建立的全新多疾病诊断平台。

从防污涂层到多通路传感器平台

在获得初步成功之后，该团队针对防污涂层的成分进行了进一步优化。
主要的优化方向为原始涂层中的纳米金材料：其会对血液和其他体液中的分子进行氧化并产生干扰性的电化学背景信号，也被称为噪声。除此之外，使用纳米金的高成本也阻碍了研究人员实现以低成本制造诊断型电化学传感器的目标。
在该团队发表于 Advanced Functional Materials 上的研究论文中，研究人员使用还原氧化石墨烯纳米薄片（rGOx）替代了涂层中的纳米金作为导电材料，以便克服以上问题。
还原氧化石墨烯（rGO）是通过将氧化石墨烯进行还原得到的。由于还原方法的不同，石墨烯的品质和导电性能将产生差异：可以分别还原为绝缘体、半导体和导体。
在试验中，rGOx 的加入进一步提高了涂层的防污性能。与此前使用纳米金的试验数据相比，新型传感器针对 IL-6 的检测灵敏度提高了 40.86%。
除此之外，rGOx 改善了纳米复合材料涂层的稳定性。新型电化学传感器能够持续暴露在血清、血浆或全血中 1 小时，且不会影响其导电性能；在长达九周的稳定性试验中，其持续暴露于人血浆中同样能够维持 90% 的电流密度，这将为开发在复杂生物介质中稳定工作的连续监测生物传感器提供可能。
图丨基于 BSA/rGOx/GA 结构的涂层稳定性数据（来源：Advanced Functional Materials ）
“这种稳定的传感器可以支持先取样，然后可以在实验室中集中检测等灵活的处理方式。” 论文的第一作者 Sanjay Timilsina 说。
在解决污染问题后，研究团队基于涂层电极，搭建起了灵敏的电化学 ELISA 测试系统。
由于污染物的减少，复杂生物样品与电极接触时的非特异性作用也相应降低。通过引入多重亲和剂，显著增加对于待测分子的选择特异性。最后在沉淀剂的作用下，使待测物 “降落” 到电极上，以增强离子电流的方式实现检测信号的输出。
（来源：Advanced Functional Materials）
“局部沉淀法” 使得构建多通道传感阵列成为了可能：在紧密排列的不同电极上，搭载有针对不同待测分子的捕获探针，这些电极共享一个参考电极。
在这之后，该团队针对 eRapid 技术开始了首次真实世界试验。着眼于新冠疫情期间各个地区在即时诊断方面的巨大差距，他们与 iQ Group Global 集团下的子公司 GBS Inc. 展开合作，使用 eRapid 技术设计出专用于 COVID-19 诊断检测。目前，该项目已进入临床试验阶段。
与此同时，该团队与巴斯大学也展开合作，开发首个针对于败血症诊断的多通道检测设备 —— 同时检测三种在败血症患者血液中呈现高值的生物标志物：降钙素原 (PCT)、C 反应蛋白和病原体相关分子模式 (PAMPs) 。
此前，该疾病的诊断主要依靠 ELISA 法，由于难以实现快速、准确的诊断，仅在美国每年就有至少 170 万成年人因为败血症面临性命之忧。
经过实验证明，多通道电化学传感器在临床相关范围内产生响应，而不同的绝缘传感器元件之间不会产生干扰。因此，针对同步进行生物标志物检测的 eRapid 平台的进一步临床开发可以提供更快、更准确的败血症诊断分析。
为了实现这一目标和其他快速反应的诊断应用，该团队在最新的预印本研究中将败血症特异性传感器与微流体系统相结合，使诊断过程自动化，以便在更短的时间内从更少的血液样本中持续获得结果。
（来源：Accounts of Chemical Research）
“这种速度在该领域和科学文献中是前所未有的，迄今为止我们取得的进展为设计即时诊断开辟了道路，仅需不到一小时的测试时间和必须持续监测生物标志物的长期应用，”Jolly 说。“我们确信我们拥有一个多功能且强大的平台，通过对其进行功能化修饰，能够实现从小分子到蛋白质和抗体的各种分析物的检测。”
在 eRapid 平台中设计生成的最新电化学传感器当中，Ingber 的团队还通过确定多种生物标志物的水平，创建可能用于检测心肌梗塞和脑震荡的设备。此外，在与 Wyss Core Faculty 成员 James Collins 博士和 David Walt 博士小组合作进行的其他未发表的工作中，eRapid 团队为 COVID-19 的即时诊断应用设计了电化学传感器，结合 CRISPR 技术将同时检测新冠病毒 RNA，以及受感染个体产生的抗体。

简化 eRapid 传感器生产

诊断平台的一个重要属性是制造测试设备的简便性、一致性和速度，以及组件的存储稳定性。目前，研究人员已将这些功能设计到 eRapid 平台中，作为其发展的另一个关键步骤。该研究论文已被提交于 medRxiv 预印本服务器上并等待发表。
使用石墨烯纳米薄片制造防污涂层，原则上可以更好地实现低成本、大规模制造和长期存储电化学设备的目标。
与第一代基于纳米金颗粒的涂层相比，使用石墨烯将材料成本降低了约 99%。
最初，在 eRapid 传感器上制造涂层大约需要 24 小时；然而，在团队开发了一种简化的 “浸涂方法” 后，现在完成涂层工艺仅需不到一分钟。
“该方法还可以用于预组装的涂层混合物，它们能够在室温下储存至少五个月，仍保持原始电化学响应水平的 85% 以上。”
“这种快速而直接的新方法，为具备高效防污涂层的多通路诊断电化学传感器的批量制造和商业化打开了大门”Jolly 说。
从解决电化学诊断传感器的生物污染问题开始，eRapid 电化学传感器技术已经通过团队逐步推进其成熟诊断平台的愿景，该平台已准备好应对众多现实世界的医疗挑战。
编译丨宋哲璇
参考资料：
  • https://wyss.harvard.edu/news/erapid-developing-a-multiplexed-electrochemical-diagnostic-platform-from-the-ground-up/
  • https://doi.org/10.1038/s41565-019-0566-z
  • https://doi.org/10.1002/adfm.202010638
  • https://doi.org/10.1021/acs.accounts.1c00382
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