技术丨测序技术发展史
在我心中，近100年生物技术最大的突破就是测序技术，正是由于测序技术的不断进步才使得人类可以破解生命的密码。但是一直以来由于成本较高加之技术复杂，大多数检测实验室始终无法将测序作为常规检测方法。近年来来随着纳米孔测序的兴起，使得大多数实验室使用测序作为常规检测的时代不再遥远！本文将从检测的角度来阐述测序技术。
基因测序技术发展历史▲
一、一代测序（Sanger法测序）
一代测序技术指的是由1975年Frederick Sanger发明的Sanger双脱氧链终止法（Chain Termination Method）。基于第一代测序技术的测序仪几乎都是采用该方法。其核心原理是采用ddNTP取代dNTP，在合成核酸链的过程中ddNTP无法形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。对每个ddNTP进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后通过毛细管电泳进行分离，通过检测荧光信号获得DNA序列。
一代测序特点：
准确度：测序的金标准，准确度高于二代和三代测序；
测序长度：单端700-1000bp，比二代长，比三代短；
测序成本：低；
测序通量：一个反应只能得到一条序列，测序通量低；
PCR：由于测序是基于PCR产物，因此会出现非特异扩增和高GC片段扩增效率低等问题。
数据分析：要求低，多序列比对软件即可。
Sanger法测序是目前实验室使用最广泛的测序技术，常用来对临床检测为阳性的样品，进行测序进一步获得序列信息，进而进行基因分型。很难完成大基因组测序。
Sanger法测序▲
二、二代测序
（高通量测序(High-Throughput Sequencing, HTS）；
新一代测序 (Next Generation Sequencing, NGS) ）
其特点是一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，目前主流的二代测序平台有3种，分别为：Illumina公司的Hiseq平台；Themo fisher公司的Ion Torrent平台和华大基因MGISEQ 平台，另外还有2016年退出市场Roche公司的454这里就不介绍了。
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Illumina公司的Hiseq平台
首先通过不同的方法将打碎的DNA碎片末端连接序列已知的接头，构建单链DNA测序文库。将测序文库的每一条单链DNA通过特异性的接头固定在一个固体支撑体上，固体支撑体的每一个单独小空间中只包含一条DNA链，之后通过PCR特异性的将模板DNA进行富集，从而达到测序所需的模板量。反应过程中加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，用激光扫描反应板表面，根据dNTP多带的荧光读取每条模板序列每一轮反应所聚合的核苷酸种类，经过“合成-清洗-拍照”的循环过程，最终得到目的片段的碱基排列顺序。Illumina测序是通过荧光信号和拍照的方式来识别核苷酸的序列。
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Themo fisher公司的IonTorrent平台
所采用的技术为半导体测序，通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号。自然情况下，DNA聚合酶将一个核苷酸渗入到DNA分子中就会释放出一个H+，导致局部可检验的PH值发生变化。如果发生结合，就会释放H+,相应的溶液PH值会发生改变，被离子传感器检测到，从而转换为数字信号。
该方法比Illumina平台测序速度更快但是数据量小于Illumina。
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基因组DNA首先经过片段化处理，再加上接头序列，并环化形成单链环状DNA，随后使用的滚环扩增技术（Rollingcircle amplification, RCA）可将单链环状DNA扩增2-3个数量级，所产生的扩增产物称为DNA纳米球（DNAnanoball, DNB），最终纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上。DNA分子锚和荧光探针在DNB上进行聚合，随后高分辨率成像系统对光信号进行采集，光信号经过数字化处理后即可获得待测序列。目前该平台资料较少，是我国的骄傲！
二代测序特点：
准确度：单条可达99.9%准确度，高于三代测序，低于一代测序；
测序长度：单端100-150bp，比二代和三代短；
测序成本：单次测序成本中等，单个碱基测序成本最低；
测序通量：可达数百万条以上片段，几十G-几T的数据量；
PCR：由于建库中利用了PCR扩增，会产生PCR的偏好性和一定概率的碱基错配。
数据分析：要求高，需要专业的生物信息学分析工具。
二代测序在前几年资本市场的推动下风生水起，涌现了一大批上市公司，因此服务体系完善，产品成熟。从检测的角度，二代测序可用于宏基因组的检测，遗传病和肿瘤基因的检测。
三、三代测序（单分子测序）
在2011年和2014年，PacBio和Oxford Nanopore Technologies，ONT公司分别发布了新型的单分子测序技术平台，这种突破性的测序技术被成为第三代测序技术。与前两代测序技术相比，其最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，并且理论上可以测定无限长度的核酸序列。
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PacBio平台
每个ZMW (零模波导孔)只允许一条DNA模板进入，DNA模板进入后，DNA聚合酶与模板结合，加入4种不同颜色荧光标记4种dNTP，其通过布朗运动随机进入检测区域并与聚合酶结合从而延伸模板，与模板匹配的碱基生成化学键的时间远远长于其他碱基停留的时间，因此统计荧光信号存在时间的长短，可区分匹配的碱基与游离碱基。通过统计4种荧光信号与时间的关系，即可测定DNA模板序列。
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将在某一面上含有一对电极的特殊脂质双分子层置于一个微孔之上，该双分子层中含有很多的纳米孔，并且每个纳米孔会结合一个核酸外切酶。当DNA模板进入孔道时，孔道中的核酸外切酶会“抓住”DNA分子，顺序剪切掉穿过纳米孔道的DNA碱基，每一个碱基通过纳米孔时都会产生一个阻断，根据阻断电流的变化就能检测出相应碱基的种类，最终得出DNA分子的序列。
三代测序特点：
准确度：单条序列的准确率约85%，拼接后可达99%，准确度低于二代测序和一代测序；
测序长度：单端几百bp-几M，长度最长；
测序成本：目前比二代和一代测序成本高；
测序通量：可达数百万条以上片段，几十G-几T的数据量；
PCR：无需PCR，直接测序。
数据分析：要求高，需要专业的生物信息学分析工具。
其他：可进行RNA直接测序，Nanopore的minion测序仪可以做到随身携带。
Nanopore的Minion便携式测序仪是第一款普通实验室都可以配置的测序仪，也使得测序技术可以真正广泛应用于临床检测。
由于三代测序的高错误率和长度长特征，目前最适合应用于临床样品的宏基因组检测。
目前除测序外的核酸检测方法都是基于已知的和特异性的核酸片段，但是检测的终极目标是一网打尽，“应检尽检”，随着测序技术的进步，这样的时代很快就会来临！