新发现！转录组 + 蛋白组 + 代谢组三组学联合揭示前列腺癌病理机制及独立预后生物标志物 | 生物360

前列腺癌 (PCa) 是全球第二常见的癌症，也是男性癌症死亡的第五大原因。前列腺活检后的治疗是个性化的，但目前仍然存在过度治疗或治疗不足的风险很大，迫切需要额外的风分级生物标志物。

维也纳医科大学病理部 Lukas Kenner 研究团队在《Molecular systems biology》（IF:11.429，中科院 JCR 1 区）上发表题为 “STAT3-dependent analysis reveals PDK4 as independent predictor of recurrence in prostate cancer” 的研究论文。研究者利用转录组学数据的基因共表达网络，以及来自人和鼠前列腺 FFPE - 激光显微切割样本的蛋白质组学，寻找前列腺癌潜在的风险分级生物标志物。在转录水平上显示了氧化磷酸化 (OXPHOS) 的上调，在蛋白质组水平上显示了 TCA 循环 / OXPHOS 的上调，这与 STAT3 的表达呈负相关。同时，作者鉴定到 TCA 循环的关键调节因子──丙酮酸脱氢酶激酶 4 (PDK4)基因的表达，独立于其他诸如分级、分期和前列腺特异性抗原（PSA）水平的诊断风险因素，低 PDK4 是前列腺癌预后不良的一个有前景的标志物。

总体技术路线

研究结果

作者先分析了 498 名原发前列腺癌患者的 TCGA PRAD RNA-Seq 数据，并进行了如下两个方向的探索：

（1）比较低 STAT3 和高 STAT3 患者的差异基因。

共发现有 1194 个显著差异基因 (FC ≥ 2，FDR ≤ 0.05)。KEGG 通路富集显示核糖体和氧化磷酸化（OXPHOS）在显著上调的通路中。同时，和低 STAT3 组相比，STAT3 的靶基因在高 STAT3 组中显著上调。表明 STAT3 基因表达与其作为转录因子的活性相关。STAT3 在酪氨酸磷酸化(pY) 的形式下作为转录因子发挥作用。

（2）进行 WGCNA 共表达网络分析，以获得高度相关的基因簇。

共得到了 13 个基因簇，GO 分析获得了每个基因簇富集的生物过程（下图 A）。簇 2 中的基因主要与细胞呼吸 (OXPHOS，“线粒体呼吸链复合体组装” 和“RNA 剪接”) 相关。簇 3 代表核糖体翻译和靶向内质网的蛋白质。簇 2 和簇 3 与 STAT3 表达有相对更显著的负相关关系（下图 B）。前 50 个负相关基因的 GO 生物过程分析又进一步表明，STAT3 表达与 OXPHOS 和核糖体活性相关的基因呈负相关（下图 D&E）。

研究人员对 GSC 分级为 7、8 的各 6 个前列腺癌 FFPE 样本和 7 个健康前列腺组织 FFPE 样本进行蛋白质谱检测。共检测到 1949 个蛋白，PCA 并未有清晰的分组，三组间也未分析得到显著差异蛋白。而高 STAT3 和低 STAT3 组间比较得到 30 个差异蛋白（FC>2）。与前述 TCGA 分析结果一致，代谢途径 “OXPHOS” 和 KEGG 途径 “TCA 循环” 被上调。“上皮间质转化”和 KEGG 途径 “细胞外基质 - 受体相互作用”、“局部粘附” 和 “蛋白质消化和吸收” 被下调。与转录组数据相似，低 STAT3 样品显示 OXPHOS 基因组的富集。此外，TCA 循环被上调，以及为 TCA 循环提供中间体的支链氨基酸降解和脂肪酸降解也上调了（下图）。

为了了解前列腺癌小鼠模型的蛋白组学是否可以反应从人样本中得到的结果，作者使用了此前构建的基因工程前列腺癌小鼠模型：前列腺上皮细胞中条件性缺失 Pten(Ptenpc-/-) 或 Pten 和 Stat 3 共缺失 (PtenStat3pc-/-) 小鼠模型。研究者从每个基因型 (野生型（WT）、Ptenpc-/- 和 PtenStat3pc-/- 中各取 3 只小鼠的 FFPE 激光显微切割（LMD）样本进行蛋白质组检测。平均检测到 2994 个蛋白质 (2052-3465)，其中 1510 个在所有三组之间差异表达(F≥1，FDR< 0.05)。PCA 主成分分析显示各组之间有明显的差异。PtenStat3pc-/- 和 Ptenpc-/- 比，STAT3 是差异表达最显著的蛋白(下图 A 和 B），KEGG 富集分析中“核糖体” 和“内质网中的蛋白质加工” 最为显著(下图 C)。由于研究者观察到人样本中的代谢变化，在 PCa 小鼠模型中进一步研究了这些变化，发现 Ptenpc-/- 与 WT，TCA 循环和氧化磷酸化的上调（下图 D）。

随后，研究者对 WT（n=5）、Ptenpc-/-（n=5）和 PtenStat3pc-/-（n=3）的小鼠进行了非靶向代谢组检测，最终发现，与 WT 相比，TCA 循环相关的代谢物在 PtenStat3pc-/- 中显著高表达（下图 E）。

鉴于前面研究发现 TCA/OXPHOS 的上调，作者想探究是否有 TCA/OXPHOS 相关基因可作为潜在的生物标志物。作者对来自 80 个患者的原发性前列腺癌和癌旁组织进行了 SDHB（琥珀酸脱氢酶复合体帖硫亚基 B）和 IDH2（异柠檬酸脱氢酶 2）的 IHC 染色，最终确认，和正常组织相比，SDHB 和 IDH2 在肿瘤组织中高表达，其中 Gleason 分级 5 的肿瘤样本中 SDHB 和 IDH2 的表达丰度比 Gleason4 级和 3 级的表达丰度都更高（下图 A、B、C&D）但 IDH2 和 SDHB 蛋白与生化复发（BCR）等并未有显著相关性。

考虑到 TCA 循环的激活和 OXPHOS 的增强在前列腺癌发生中是非常重要的事件，但本研究并未发现其和生化复发（BCR）之前的显著关系，于是研究者想要去找能拮抗 TCA/OXPHOS 的基因。

在前述的 TCGA 数据中，丙酮酸脱氢酶激酶 4（PDK4）在低 STAT3 组中是显著低表达的 (下图 B)。丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）包括 PDK1-4，能磷酸化丙酮酸脱氢酶复合体（PDC），降低其活性，结果就是 TCA 循环和 OXPHOS 的代谢通量降低（下图 A）。研究者在一个已发表的 MSKCC 数据中分析了 PDK4 表达和前列腺癌的生化复发（BCR）的关系。最终发现，PDK4 是原发前列腺癌或转移性前列腺癌的生化复发（BCR）预测因子（下图 C&D）。此外，研究者还进一步确认，PDK4 是独立于 ISUP 分级、临床肿瘤分期以及病理肿瘤分期和肿瘤术前 PSA（前列腺特异性抗原）水平的原发性和转移性前列腺癌的预测因子。其他 4 个测试数据的结果也显示了同样的趋势：低 PDK4 水平预示着更早的生化复发或死亡。

为了研究 STAT3 和 PDK4 联合对生化复发（BCR）的影响，作者将患者重新分组为：低 STAT3 / 低 PDK4、高 STAT3 / 高 PDK4 和混合组 (低 STAT3 / 高 PDK4 和高 STAT3 / 低 PDK4)，并发现低 STAT 3 / 低 PDK4 显示了更早的生化复发（下图 A）。

在人前列腺癌细胞系 22Rv1 的 WB 实验中，STAT3 敲低细胞（shSTAT3）中 PDK4 的表达水平降低，这意味着 STAT3 对 PDK4 有调控作用（下图 B）。为验证 PDK4 是否可能是 STAT3 的直接转录调控靶标，作者通过分析已发表的 STAT3-ChIP-seq 结果确认 STAT3 可以结合 PDK4 的启动子。作者又通过在前列腺癌细胞系 22Rv1 中的 ChIP-PCR 及 WB 实验进一步确认了 STAT3 对 PDK4 的转录调控（下图 C）。

总结

▪ 研究团队通过分析 STAT3 高和低的前列腺癌转录组数据发现，低 STAT3 表达与高的氧化磷酸化 (OXPHOS) 和核糖体生物合成相关。▪ 接着分别用人和小鼠的前列腺癌 FFPE 样本进行了蛋白组学分析，进一步确认了低 STAT3 表达与高的氧化磷酸化 (OXPHOS) 和核糖体生物合成相关。▪ 在随后的分析中，研究者又发现，一个在 TCA 循环和氧化磷酸化 (OXPHOS) 中起重要作用的丙酮酸脱氢酶激酶 4（PDK4）和前列腺癌的生化复发相关。▪ 最终确认，PDK4 是一个独立于其他诸如分级、分期和前列腺特异性抗原（PCA）水平的前列腺癌预后标志物，具有潜在的临床应用价值。

做蛋白组学 · 找吉凯

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