科研 | Cell Metabolism：下丘脑中的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体表达细胞调节食物摄入(IF=22.415)
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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关于葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）在肥胖中的作用，科学界尚未达成一致，已有的研究认为GIP受体（GIPR）激动剂和拮抗剂都是抑制体重增加的有效策略。为了能够鉴定和操控表达Gipr的细胞，研究者构建了Gipr-Cre敲入小鼠。由于最近报道GIPR激动剂可抑制食物摄入，本研究的目的是确定这种效应的中枢调节基因。作者在下丘脑的弓形核、背内侧核和室旁核中鉴定出Gipr细胞，并用小鼠和人的RNAscope分析进行验证。单细胞RNA-seq鉴定出下丘脑Gipr细胞簇，其表现出血管、神经胶质和神经元细胞的转录组学特征，但神经元细胞表达生长激素抑制因子，几乎没有阿黑皮素原或刺鼠相关肽的表达。下丘脑Gipr细胞中Gq-DREADD的激活抑制了食物摄入，这显然并没有伴随GLP1R的激活。这些数据表明，下丘脑的GIPR是调节能量平衡的靶标。
论文ID
原名：Glucose-Dependent Insulinotropic Polypeptide Receptor-Expressing Cells in the Hypothalamus Regulate Food Intake
译名：下丘脑中的葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体表达细胞调节食物摄入
期刊：Cell Metabolism
IF：22.415（一区）
发表时间：2019.8
通讯作者：Fiona M. Gribble、Frank Reimann
通讯作者单位：英国剑桥艾登布鲁克医院
DOI号：https://doi.org/10.1016/j.cmet.2019.07.013
实验设计
组织样本：人下丘脑组织来源于剑桥脑库（Cambridge Brain Bank）。小鼠下丘脑组织来源于4-6周龄的GiprEYFP和GiprGCaMP3小鼠。组织样本进行RNAscope分析。
小鼠身体成分分析：Gipr-Cre纯合、杂合子及野生型小鼠在6-7周龄时喂食高脂饲料（HFD），喂食17周，每周测2次体重。17周过后，小鼠使用时域核磁共振仪（TD-NMR）进行身体成分分析。
免疫组化分析：小鼠胰腺和脂肪组织以6-10µm的厚度进行冰冻切片，使用proglucagon、insulin和EYFP抗体进行免疫组化分析。小鼠大脑组织以25µm的厚度进行冰冻切片，使用EYFP抗体进行免疫组化分析。通过共聚焦显微镜获取图像。
荧光细胞分选：2-3只GiprEYFP小鼠进行显微解剖得到下丘脑组织，制成单细胞悬液，在细胞分选仪上进行荧光细胞分选。
单细胞测序：荧光细胞分选得到的细胞悬液，制备10X Genomics Chromium文库，使用Illumina HiSeq 4000平台测序。测序数据经过质量过滤后，使用CellRanger（v2.0）软件比对到小鼠参考基因组上（mm10），使用R语言Seurat（v2.3.4）进行下游分析。
实时荧光定量PCR：使用RNeasy试剂盒进行RNA抽提，使用SuperScript II Reverse Transcriptase试剂盒进行逆转录，使用TaqMan探针的方法在ABI QuantStudio 7实时荧光定量PCR仪上进行基因定量。
钙成像：使用连接到Olympus IX71倒置荧光显微镜的Hamamatsu Orca-ER数码相机（Cairn Research）进行成像实验。
小鼠病毒注射和食物摄入测量：所有小鼠以75nL/min的速率，对下丘脑区域进行500nL的病毒注射。所有食物摄入研究均以交叉方式进行。小鼠术后2周恢复后，注射测试物1小时、2小时、4小时、8小时和24小时后对食物称重。
数据分析：数据以平均值和标准差表示。使用Microsoft Excel和GraphPad Prism7.0进行统计分析。单重比较分析使用t检验，多重比较分析使用双因素方差分析（2-way ANOVA）进行。
结果
Gipr基因在大脑神经元和神经胶质细胞中都有表达
尽管两种GIPR拮抗剂抗体已被报道，但均未用于免疫组织化学定位。为了标记Gipr细胞，研究者构建了敲入小鼠模型（Gipr-Cre），其中Cre重组酶取代了Gipr编码序列，从而可以对Gipr细胞进行遗传和化学操控。Gipr-Cre纯合的小鼠为Gipr基因失效状态。与同窝Gipr基因杂合敲除小鼠和野生型（WT）小鼠相比，Gipr基因纯合敲除小鼠在接受高脂饮食（HFD）17周后可以阻止体重增加，并且脂肪百分比显着降低，这与已报道的另一个Gipr基因敲除（KO）小鼠模型结果一致。尽管由于杂合敲除而导致Gipr表达降低，但是Gipr-Cre杂合子小鼠与野生型小鼠体重增加相似。
通过将Gipr-Cre小鼠与ROSA26-EYFP报告基因小鼠（GiprEYFP）杂交，研究者在目标组织中鉴定了Gipr细胞。如预期的那样，通过对GiprEYFP小鼠胰腺中EYFP进行染色，鉴定到Gipr基因在α和β细胞中表达。在胰腺的周围外分泌组织中也发现了异质EYFP染色。一部分棕色和白色脂肪组织的脂肪细胞对EYFP染色也呈阳性。这些数据表明Gipr-Cre转基因成功靶向了Gipr表达细胞，与已知的Gipr基因表达模式一致。为了构建Gipr基因定位图，研究者对GiprEYFP小鼠的大脑进行了连续切片，并对EYFP进行了染色。结合原位杂交的数据，中枢神经系统内的染色相当普遍，包括下丘脑的关键进食中心区域，例如弓形核（ARC）、室旁核（PVN）和背内侧核（DMH）（图1A）。qPCR结果证实了小鼠下丘脑中Gipr基因的转录（图1B）。
为了创建下丘脑中Gipr细胞的表达谱，研究者使用流式细胞荧光分选技术（FACS）对GiprEYFP小鼠下丘脑的Gipr细胞进行了纯化，并对它们的转录组进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。基于图谱的聚类分析表明，下丘脑Gipr细胞分为六个亚群（图1C）。根据细胞特异表达基因以及富集发现的标记基因进行细胞簇划分（图1C和1D）。Gipr细胞的不同细胞簇可分为：壁细胞（Kcnj8、Abcc9、Mustn1和Mhy11），室管膜细胞（Ccdc153和Hdc），血管和软脑膜细胞（VLMC）（Lum和Pdgfra），少突胶质细胞（Mal和Klk6）和神经元细胞（Snap25和Syt1）。
由于下丘脑神经元可以调节进食行为，因此研究者更详细地分析了神经元细胞簇。Gipr神经元表达了GABA（Slc32a1）和谷氨酸能细胞（Slc17a6）的标记基因（图1D）。编码与能量稳态有关的Sst、Avp、Tac1和Cartpt基因，是表达较高的神经激素标记基因（图1E）。为了鉴定荧光Gipr神经元的异质性，研究者构建了一个基因共表达矩阵，包含了20种与神经内分泌信号通路相关的基因，显示了来自神经元细胞簇的各自Gipr细胞的数量。Sst基因是Gipr神经元的主要神经内分泌标记基因，在表达Sst的神经元细胞簇中有83％的Snap25阳性细胞。Avp和Pthlh基因也至少在一半的Gipr神经元中表达（分别是58％和50％），而Cartpt和Tac1基因的表达少于50％。Pomc基因在不到10％的Gipr神经元中表达，并且表达量较低。与scRNA-seq结果一致，作者通过qRT-PCR在荧光分选的Gipr细胞中检测到了高水平的Sst基因和低水平的Pomc基因。
图1 大脑中表达Gipr基因的细胞
局部和外围信号调节Gipr神经元
为了鉴定Gipr神经元中调节性细胞表面受体，研究者分析了神经元细胞簇中GPCRs家族的表达。Grm5和Gabbr1基因是Gipr神经元中表达量最高的GPCRs家族基因，Gipr神经元也表达谷氨酸和GABA的离子型受体（Gria2、Gria3、Grin2b和Gabrb1）。其他可能有助于调节Gipr神经元的神经递质包括阿片（通过Oprk1和Oprl1）、乙酰胆碱（通过Chrm1和Chrm3）、组胺（Hrh3）和血清素（Htr1b，Htr1d和Htr2c）。Gipr神经元还表达了肽神经内分泌调节剂的受体，包括SST（Sstr2和Sstr1）、降钙素（Calcr）和PACAP（Calcrl）；并表达了已知的控制能量平衡的受体，包括Cnr1、Mchr1、Hcrtr2、Tac1r、Ghsr、Cckbr和Htr2c（图2A）。
在来自GiprGCaMP3小鼠的培养的下丘脑神经元中，使用钙成像在单个细胞水平上观察到几种受体的功能活性，包括Cckbr、Ghsr和Htr2c。研究者通过qRT-PCR在分选的下丘脑细胞中证实了它们的表达。鉴于发现一些Gipr神经元表达Cartpt和Pomc基因，并且已有报道表明Lepr基因可以诱导POMC神经元中的钙内流，因此作者还检测了Lepr基因。在所测试的刺激物中，谷氨酸增加了大多数神经元的钙（40/59），而只有一部分对CCK（5/34）和GHSR激动剂hexarelin（7/73）有反应。只有1/15的神经元对瘦素有反应，没有细胞对5HT有反应（图2B和2C）。
图2 内分泌因子激活Gipr表达细胞
下丘脑Gipr细胞的激活会减少食物摄入
为了评估Gipr细胞活性精确的化学操控对食物摄入的影响，Gipr-Cre小鼠接受下丘脑注射Cre诱导的AAV，旨在优先靶向神经元，这些AAV表达Gq偶联的DREADD，hM3D（AAV-hSyn-DIO-hM3D（Gq）-mCherry），来构建GiprhypDq小鼠。在交叉研究中评估了Gipr细胞Dq激活对食物摄入的影响。
在GiprhypDq小鼠中，注射氯氮平-N-氧化物（CNO）后激活Dq受体可显着抑制自由采食和禁食动物在白天和黑夜的食物摄入（图3A–3C）。同样，在喂食HFD 2-4周的GiprhypDq小鼠中，在黑夜开始时注射CNO会显着减少食物摄入量，但在白天开始时注射CNO时未观察到明显的作用（图3D-3F）。在对照组（非AAV注射）小鼠中注射CNO后未观察到对食物摄入的影响。
图3 下丘脑Gipr细胞的激活会减少食物摄入
Gipr和Glp1r在人类和小鼠的细胞中共表达
为了研究Gipr和GLP-1受体（Glp1r）基因的共表达，研究者对小鼠和人下丘脑进行了RNAscope分析。RNAscope结果显示Gipr阳性细胞在小鼠ARC和DMH中，这与使用GiprEYFP小鼠鉴定的细胞定位一致。在这些核区中也观察到了Glp1r阳性细胞，有些细胞同时显示了Gipr和Glp1r表达（图4A–4C）。在人下丘脑切片中，研究者观察到类似地GIPR、GLP1R或两个受体都呈阳性的细胞（图4D和4E）。
Gipr和Glp1r细胞的共激活不会进一步减少急性食物摄入
为了研究同时激活下丘脑Gipr和Glp1r阳性细胞对急性食物摄取的潜在累加效应，研究者首先在Gipr和Glp1r启动子（Gipr/Glp1rhypDq）或单独的Glp1r启动子（Glp1rhypDq）控制下，将携带hSyn-DIO-hM3D（Gq）-mCherry的AAV注射到表达Cre的小鼠的下丘脑中。禁食的Gipr/Glp1rhypDq和Glp1rhypDq小鼠在黑夜开始时注射CNO后显着降低了2小时的食物摄入量（图4F）。尽管Glp1rhypDq小鼠没有统计学意义，但是Gipr/Glp1rhypDq小鼠依赖CNO的食物摄取减少了52％±9％（n=7），其大小与之前观察到的GiprhypDq小鼠减少50％±8％（n=14）结果相似（图3C）。
研究者又研究了外周给予Exendin-4（Ex-4）与Gipr细胞Dq激活相结合对食物摄入的影响。从剂量测试实验中选择了Ex-4的次最大剂量。尽管Ex-4、CNO以及Ex-4与CNO的组合给药均减少了GiprhypDq小鼠的2小时食物摄入量，但无法检测到急性食物摄入量之间的显着差异（图4G）。
图4 Gipr和Glp1r表达的细胞部分重叠，但GIP1R的激活对表达Gipr的细胞介导的急性厌食症的作用有限
讨论
在这项研究中，研究者构建了一个新的Gipr-Cre小鼠模型，可以识别下丘脑中表达Gipr的细胞，并进行了转录组学研究和功能验证。结果显示：（1）Gipr在主管进食的大脑神经元和非神经元细胞类型中都有表达；（2）下丘脑Gipr神经元表达多种神经内分泌激素和激素类或神经递质类受体；（3）直接激活下丘脑Gipr细胞可有效抑制食物摄入；（4）Gipr与Glp1r基因在人类和小鼠的下丘脑细胞中共表达。
已有的研究表明Gipr的表达与促进神经发生和突触可塑性有关。研究者发现Gipr细胞存在于ARC、DMH和PVH中，这表明GIPR信号传导也可能参与下丘脑调节能量平衡的回路中。尽管Gipr-Cre小鼠中的EYFP或GCaMP3标记可能部分源于谱系追踪，但研究者使用RNAscope观察到了相似的Gipr细胞阳性位置。在DREADD实验中，hSyn-DIO-hM3D（Gq）-mCherry的激活提供了进一步的证据，证明Cre和Gipr在成年下丘脑细胞中活跃地转录。
为了确定是否可以将Gipr细胞分配给已知的神经网络，研究者进行了scRNA-seq测序，揭示了Gipr细胞大量的异质性。尽管一些基因在细胞消化和分离过程中可能会改变它们的表达，但测序结果显示Gipr细胞聚集到几个不同的种类中，包括神经元细胞、壁细胞、室管膜细胞、VLMC和少突胶质细胞，并且每个细胞种类标记基因表达都不同。Gipr神经元几乎普遍表达Sst，许多神经元也表达Avp和Pthlh，较少表达Cartpt、Tac1和Pomc。Sst在Gipr神经元中的广泛表达引人注目，Pthlh在50％的Gipr神经元中的共表达，这表明它可能属于最近研究中鉴定出的SST神经元的Pthlh分枝。
通过化学操控激活下丘脑中的Gipr细胞导致急性厌食症。虽然下丘脑Gipr细胞急性激活后食物摄入的减少似乎与Gipr敲除小鼠免受饮食介导的肥胖症不符，但Gipr敲除小鼠表现出的对体重增加的抵抗力至少部分可能是由于胰岛素信号的减少。确实，Glp1r敲除小鼠同样具有抵抗HFD的作用，尽管GLP1R激动剂无疑抑制了食物摄入，但在HFD条件下，GLP1R抑制作用与能量消耗增加有关，表明肠降血糖素在调节食欲和肥胖方面具有复杂的作用。
当小鼠的食欲增强信号最高时，GiprhypDq小鼠在黑夜的食物摄入抑制作用很强。下丘脑Gipr细胞介导的食物摄取抑制与厌食神经肽的表达相匹配，尤其是AVP和CART，其在超过40％的Gipr神经元中表达。尽管黑皮质素轴可能在Gipr细胞介导的厌食症中起作用，但Pomc仅在少数Gipr神经元中表达且相对表达水平较低（图2E）。令人惊讶的是，大多数Gipr神经元都表达了Sst，因为在ARC中与Dq一起激活的所有五个Sst阳性神经元分枝（分别由Th、Nts、Agrp、Unc13c或Pthlh的共表达定义）显示是致食性的。相比之下，结果表明表达Gipr的Sst阳性细胞群的特异性激活（Pthlh阳性，而Agrp阴性）会导致厌食。尽管无法将Dq激活所见的明显的厌食作用与确定的细胞群联系起来，但使用hSyn启动子的AAV可能会提示靶向的神经元，尽管需要进一步的实验来确定哪种Gipr细胞类型会导致食物摄入抑制。
药理学GIPR和GLP1R激动剂对食欲的协同作用表明，GIPR信号级联作用可能会引起下丘脑细胞对其他厌食信号敏感的作用。GLP-1部分地通过表达GLP1R来抑制食欲。由于本研究的RNAscope分析揭示了下丘脑中细胞群中Gipr和Glp1r基因表达的部分重叠，GIP和GLP-1受体共激活的有益代谢作用可能来自两种受体在同一细胞的协同作用或不同神经元下游信号的整合作用。由于Gipr细胞的GLP1R和Dq共激活缺乏对急性厌食症的累加效应，这表明需要长期激活GIPR来增强GLP1R激动剂的厌食作用。研究者在非神经元细胞（包括可能有助于血脑屏障的细胞）中鉴定到Gipr的激活，增加了GLP-1和其他循环激素随意进入中枢核区的可能性。未来的工作应解析长期GIPR激动剂治疗的分子机制。
评论
总而言之，研究者在小鼠和人类中鉴定了表达Gipr的下丘脑细胞种群，证明了它们的急性激活可以有效地减少食物摄入，确定了下丘脑中央GIP信号轴是控制能量稳态的另一个原因。