编译：杨峰，编辑：十九、江舜尧。
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导读
几十年来，对癌症生物学的研究主要集中在蛋白质编码基因的参与上。直到最近才发现一大类分子，称为非编码RNAs (ncRNA)，在调节细胞活动中发挥着重要的作用。对ncRNA生物学的大量研究表明，ncRNA代表了一类多样化和普遍存在的RNA，包括致癌分子和一些发挥抑癌作用的分子。因此，数以百计的以癌症为中心，涉及ncRNAs作为新的生物标志物或疗法的临床试验已经开始，而这些可能仅仅只是个开始。原名：The Role of Non-coding RNAs in Oncology
译名：非编码RNAs在肿瘤学中的作用
发表期刊：Cell
影响因子：36.216
发表时间：2019年11月
通讯作者：Frank J. Slack & Arul M. Chinnaiyan
作者单位：哈佛医学院 密歇根大学
尽管非编码RNA(ncRNA)是目前生物医学科学中最热门的研究课题之一，但它的重要性直到最近才被人们所认识。RNA曾经被认为主要是一种信使，它可以携带DNA编码的指令，以便于其他分子，如核糖体，可以利用这一编码来生产蛋白质。然而，在过去的30年中，研究人员发现存在有多种类型的RNA，其中最重要的是ncRNA，它并不参与蛋白质生产。随着研究的深入，数以万计的ncRNA的发现彻底改变了这个领域，改变了科研人员思考生理学和疾病发展的方式。ncRNAs占人类基因组RNA的90%以上，但在过去的10年间仅有5万多的ncRNAs被发现，而且大部分仍未被研究。尽管如此，许多ncRNAs已经被证明在正常的细胞功能和疾病(包括癌症)中都扮演着关键的角色，并且这些发现正被积极地应用于临床。一些小的ncRNAs是如此稳定以至于它们可以存在于血液中，并且可以作为在血液中准确而敏感地筛查大部分人类癌症的基础。此外，ncRNAs也可以作为治疗的靶点和ncRNAs的传递可以建立在现有的基础上，这些基础是关于靶向蛋白编码mRNAs的RNAi和寡核苷酸的传递。事实上，随着第一种RNAi药物Onpattro（patisiran；降低治疗神经退行性疾病遗传性甲状腺素淀粉样变性的TTR水平）和RNA靶向寡核苷酸药物Spinraza（nusinersen；增加全长SMN2治疗神经肌肉疾病脊髓性肌萎缩症的水平)的出现，RNA在医学上的研究已经出现了复兴。此外，基于一类称为microRNA（miRNA）的ncRNA的药物的临床试验已经开始用于治疗癌症，这种药物可以增加或减少靶向miRNA。在这篇综述中，研究者将讨论与癌细胞生物学相关的ncRNAs及其与当前临床实践的相关性。首先探讨不同种类的ncRNAs（miRNAs，tRNA，tsRNAs、piRNAs、lncRNAs、假基因和circRNAs）的复杂性，并提供了这些分子在影响癌症过程中具有深远作用的基本例子。然后研究人员讨论了对这些ncRNA生物学的基础科学见解如何被用于开发下一代癌症诊断和治疗。随着基因组中所谓的“暗物质”不断被曝光，很明显研究靶向ncRNA的信号对癌症患者的治疗有很大的潜在影响。几十年来，基因组中微小的蛋白质编码部分一直是医学研究的主要焦点。人类基因组的测序显示，只有2%的基因最终编码蛋白质，科学界的许多人认为剩下的98%只是非功能性的“垃圾”。然而，ENCODE项目揭示了基因组中非蛋白质编码部分被复制到数千个RNA分子中，这些RNA分子不仅调节诸如生长、发育和器官功能等基本的生物学过程，而且似乎在人类疾病，特别是癌症中起着关键作用。富有开创性的研究使人们逐渐了解了ncRNA分子如何编码、解码、调节和表达基因以及它们如何相互沟通。这种对ncRNA调控作用的认识揭示了基于碱基互补配对的特定ncRNA网络在不同癌症类型中的作用，这反过来为该领域的科学家开发针对人类基因组制备的ncRNA的特定癌症治疗和预防策略提供了可能。癌症的特征是细胞生长（增殖）失控，能够扩散到其他组织（转移），并通过细胞死亡（凋亡）的有序过程丧失死亡能力。ncRNA的发现为理解癌症是如何发展的，以及如何治疗癌症增加了一个新的维度，它为了解其他基因组的影响提供了一个窗口。研究者在后面的章节中将详细介绍的解除调控的ncRNA表达和随后的下游信号传导过程，直接与癌症的发展和进展有关。基因编码的遗传变异ncRNAs已被发现与癌症有关；然而，与蛋白质编码基因相比，迄今为止相关的报道还比较少。最显著的例子是慢性淋巴细胞白血病（CLL）中13q14.3可能缺失，从而删除miR-15/16肿瘤抑制因子。相反，在癌症中也发现编码致癌ncRNAs的染色体区域的扩增，包括lncRNAs FAL1的扩增，lncRNAs H19、ANRIL和CCAT2基因中的单核苷酸多态性（SNPs）也与癌症发生的不同风险有关。除了转录区域内的遗传改变外，ncRNAs启动子的突变可导致基因表达水平的改变，如乳腺癌中lncRNAs NEAT1和RMRP启动子的反复驱动突变。除了编码ncRNA本身的序列的异常，ncRNA的生物发生所涉及的酶的突变或失调与癌症有关，如Drosha和Dicer参与miRNA的加工。除了这些遗传机制外，ncRNA表达的上调或下调还可能通过表观遗传、转录或转录后过程发生。ncRNA可以根据其大小大致分为不同的类别。在癌症中重要的小ncRNAs包括miRNAs、tsRNAs和piRNAs。另外就是lncRNA，其特征是长度大于200nt的未翻译RNA，包括假基因和circRNAs等。在2000年前后，第一批miRNAs，lin-4和let-7，通过在秀丽隐杆线虫中的发育研究被鉴定出来。miRNAs是长度为22nt，通过miRNA的5’端（称为“种子”）与靶RNA的互补序列结合来调节其他RNA的表达，特别是mRNA。编码miRNAs的基因由RNA聚合酶II转录，其在进化上比较保守。在典型的处理过程中较长的原始转录本，称为pri-miRNA，形成一个特征性的发夹结构，由Drosha和DGCR8组成的酶识别，切割成长度为60 nt的前miRNA，并通过Exportin 5和Ran-GTP复合物输出到细胞质中。前miRNA的末端被Dicer酶切割形成miRNA双链，由5’磷酸和2nt 3’端组成。miRNA双链中的一条，即引导链，被装载到一个Argonaute蛋白上，并被选择用于形成包含成熟22nt miRNA的RNA诱导沉默复合物（RISC）。成熟的miRNA通过与mRNAs的3’非编码区（3'UTR）结合而发挥作用，并通过降解或抑制翻译进而抑制它们的使用。多个研究试图解释不同物种中miRNAs的数量，对人类来说，miRBase v22将高表达的成熟miRNAs的数量定为2654个，但是来自其他数据库（如MirGeneDB2.0）的算法将这个数字减少到588个。尽管它们的绝对数量存在差异，但很明显，miRNAs对下游过程有着深远的影响，因为超过60%的编码基因是miRNAs的潜在靶标。此外，在整个系统发育过程中，数百个miRNAs在其种子区是保守的，这表明它们在动物的发育或生理过程中起着关键作用。关于癌症，miRNAs为发现新的遗传危险因素提供了一条强有力的新途径。在小ncRNA的类型中，miRNAs是迄今为止在癌症中研究最为广泛的一种，而tsRNAs和piRNAs的研究则相对较少。miRNAs在所研究的所有癌症类型中都被发现有改变，并且miRNAs的改变在影响癌症状态的分子和细胞过程中起着至关重要的作用。尽管研究人员仍在了解miRNAs对癌症的调控程度，但这些小ncRNAs似乎仅以两种方式中的一种发挥作用，即作为促进癌症生长或转移的肿瘤抑制因子或致癌基因。虽然小，但是miRNAs是强大的，每个分子往往能够调节一个以上的目标，反之亦然，mRNAs往往是几个miRNAs的靶向目标。因此，miRNAs作为主调节因子，控制成千上万的编码基因和非编码基因的表达，包括大多数潜在的癌基因，如RAS、MYC和EGFR，以及关键的肿瘤抑制因子，包括TP53、PTEN和BRCA1。表1提供了一个选择的miRNAs（以及来自其他ncRNAs类别的例子）的列表，这些miRNAs具有体内实验证据来支持致癌、抑癌或上下文相关的作用。其中许多研究都涉及到转基因的小鼠模型和/或miRNA模拟物或拮抗剂miRNA、补充或降低靶miRNA水平的合成寡核苷酸的递送。表1进一步提供了每个miRNA被证明可以调控的与癌症相关的分子机制的实例。在这里，研究者重点介绍每个类别中的几个示例，图1和图2分别代表一种致癌途径和一种抑癌途径。
Fig1: 致癌的ncRNAs及其促癌机制
研究表明，miRNAs可作为癌基因发挥作用，促进细胞异常生长，促进肿瘤形成。这些miRNAs可能直接抑制肿瘤抑制因子的活性，或通过消除癌基因活性的遗传抑制而间接起作用。例如，miR-155可以促进异常的B细胞增殖，导致一系列的改变，最终导致白血病和淋巴瘤的发展。重要的是，靶向miR-155的抗肿瘤药物可以抑制肿瘤生长。另一种miRNA，miR-21，在B细胞前淋巴瘤中过度表达，并通过靶向Ras信号的负调控因子与肺癌等其他癌症有关。在胶质母细胞瘤中，癌基因miRNA miR-10b的表达水平高于正常脑组织，是肿瘤生长所必需的，这些癌基因miRNA表现出癌基因成瘾（癌基因成瘾）现象，因为肿瘤依赖于miRNA的持续表达来生存，因此，抗癌治疗的重要潜在靶点。最近，靶向单个患者肿瘤中特异性高表达的肿瘤miRNA的潜力被证实，这为研究者在综述的最后讨论的个性化miRNA治疗开辟了道路。研究表明，miRNAs也可以作为肿瘤抑制因子，当它们的功能丧失时，它们的保护能力也会丧失。例如，保守的miRNA LIT-7抑制Ras，这是一种癌基因家族，约占所有人类癌症的三分之一。因此，let-7的表达可降低RAS的水平，提示其具有抑癌作用，可作为一种新的有前途的治疗药物。另外一个例子，miR-15a和miR-16-1通常作为肿瘤抑制因子，但当其突变或缺失时，与最常见的白血病类型慢性淋巴细胞白血病（CLL）的发生有关（图2A）。此外，miR-34a是miRNAs保守、冗余家族的一员，调节多种癌基因的表达，是p53的直接下游靶点。这些miRNAs在其他类型的癌症中也被禁用，如多发性骨髓瘤、肿瘤细胞淋巴瘤和前列腺癌。一些miRNAs要么作为肿瘤抑制因子要么作为癌基因发挥作用，这取决于环境。一个值得注意的例子是miR-29，它有助于防止B-CLL惰性形式的疾病进展，但在急性髓系白血病和B-CLL更具侵袭性的形式中也升高，这意味着miRNA可以也起致癌基因的作用。
Fig2: 抑癌的ncRNAs及其抑制肿瘤进展的途径就在过去的十年里，研究人员发现了一类新的与临床相关的小ncRNAs，它们来自于tRNAs，被统称为tRNA衍生的小RNAs（tsRNAs）；这些分子也被称为tRNA片段（tRFs）或tRNA衍生的应激诱导RNAs（tiRNAs）。随着一个通用命名系统的实施，它们的生物起源和下游的作用机制等许多方面仍在逐步揭示。转移RNA被RNA PolⅢ转录为前tRNAs，然后经过修饰和加工产生成熟的tRNAs。tRNA可以产生不同类型的tsRNAs，这取决于断裂发生的位置和是否在前tRNA转录本或成熟tRNA中。负责产生tsRNAs的酶仍未完全阐明，但在某些情况下，核糖核酸酶如血管生成素、Dicer和RNase Z的作用已被注意到。已经为这类新的小ncRNA建立了一些tsRNA数据库，以帮助它们的特征化。MINT base v2.0分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）的所有数据，确定了26531个唯一的来自癌组织的tsRNA序列。尽管肿瘤细胞中有大量不同的tsRNA分子和一些独特的作用机制，tsRNA在某些方面与miRNAs类似。与miRNAs一样，tsRNAs也被发现与Argonaute蛋白相关，可以通过与靶3'UTRs结合介导mRNAs的翻译抑制，并且可以致癌或抑癌。在最近一项研究中，人们发现从亮氨酸tRNA中提取的tsRNA通过调节编码核糖体成分的基因的表达，在整体蛋白质翻译中发挥作用（图1B；表1）。重要的是，研究人员认为，这种tsRNA在肝癌中上调，并以LNA寡核苷酸作为靶向在体内和体外都会导致肝癌细胞死亡。这些结果表明tsRNAs是另一个潜在的抗癌治疗新靶点。piRNAs是一类长度为21-35nt的小rna，通常与Argonaute蛋白的PIWI亚家族和转座子沉默有关。piRNA前体的产生存在物种特异性的途径，piRNA序列并不十分保守。在哺乳动物中，piRNAs是从长的、单链的转录本加工而来的，其基因组位点聚集在整个基因组中并由RNA Pol II转录，并且人类基因组中存在20000个piRNAs。如上所述，为了调节它们的作用，miRNAs与广泛表达的Argonaute蛋白家族有关联。相反，正如他们的名字所暗示的，piRNAs被装载到Argonaute蛋白的PIWI家族的蛋白质上，后者通常仅限于性腺细胞。piRNAs的经典功能是使转座子沉默，它们分为两种方式。第一种方式，piRNAs引导PIWI蛋白新生转座子转录，并在目标转座子启动子处产生抑制性染色质状态以沉默其转录。第二种方式，piRNAs将PIWI复合物引导到转座子mRNA，在那里它切割转录物。尽管传统上认为piRNAs只在性腺细胞中起作用，但最近的研究表明，几万个piRNAs中的一些在体细胞组织中表达，尽管表达水平很低，但在癌症中表达混乱，表明这些小的ncRNA也可能是一类有用的生物标记物。然而，piRNAs在体细胞组织和肿瘤中的作用仍有待阐明。发现的一些最早的lncRNA是XIST和H19。虽然最初通过分别描述X染色体失活和胚胎发育的研究确定了这两个基因，但现在这两个基因已经被列为一长串与几种癌症有机械联系的lncRNA。lncRNA的特征是由RNA Pol II从独立启动子转录的长度大于200碱基对的非编码转录物。与蛋白质编码基因类似，它们的基因组位置通过在转录起始位点富集H3K4三甲基化和在整个基因体中富集H3K36三甲基化来标记。lncRNA转录本由多个外显子组成通过典型机制剪接成成熟转录本，通常包括5'帽和3'poly（A）尾。然而，lncRNAs具有较少的外显子，并且与蛋白质编码转录物相比在较低水平上表达。有趣的是，lncRNAs在进化上也不是高度保守的，只有5%-6%的lncRNAs具有保守的序列。关于这一点，有一种观点认为高度保守的lncRNA更有可能发挥作用。然而，有灵长类特异性lncRNA可能与疾病过程有关。RNA测序（RNA-seq）表明，与蛋白质编码基因相比，独特的lncRNA转录本的绝对数量要高得多。最近一项以癌症为中心的广泛研究，MiTranscriptome数据库，分析了7256个主要来自人类组织的RNAseq文库（5298个原发肿瘤，281个转移瘤，701个正常/良性）并鉴定了58648个lncRNAs。此外，这些数据库允许对癌症中lncRNAs进行深入的探索，并最终确定了7941个特定于癌症和/或谱系的lncRNAs。与小的ncRNAs相比，lncRNAs表现出广泛的多样性来发挥其功能作用，因此需要在这一领域进行更长的讨论。lncRNA可以在顺式或反式中发挥作用，这意味着它们在自身转录位点（cis）附近介导局部效应，或者在远端的基因组或细胞位置（trans）发挥作用。不同的lncrRNA已经被证明能够在表观遗传，转录和转录后影响基因的表达水平。多个lncRNAs使其他调节分子彼此接近并与蛋白质接近，这样就相当于创建了一种柔性的分子支架，来维持细胞活性所必需的相互作用。就lncRNAs直接与蛋白质复合物结合的功能而言，最具特征性的机制之一是引导染色质修饰复合物作用于靶基因启动子以影响转录抑制/激活。注意的例子包括：HOTAIR分别在其5'和3'端结合PRC2和LSD1/CoREST/REST，以靶向启动子和调节组蛋白甲基化水平；SChLAP1，一种侵袭性前列腺癌特异性lncRNA，直接与SWI/SNF核小体重塑复合物相互作用；和ANRIL与PRC1和PRC2组分相互作用，使CDKN2B/2A抑癌基因簇中的基因沉默。lncRNAs也通常与转录因子结合，这可能对细胞转录程序产生广泛的下游影响。有趣的是，GAS5-lncRNA作为糖皮质激素反应元件（GRE）的模拟物，直接结合糖皮质激素受体（GR）的DNA结合区并阻止其激活其靶基因，包括那些阻止凋亡的基因。其他直接相互作用的伙伴包括PNADA和NF-YA转录因子，它们是p53靶向细胞死亡基因的关键激活因子，PCGEM1作为代谢主调节因子增强c-Myc活性，NKILA直接结合NF-KB/IKB复合物阻断IKK对IKB的磷酸化，以及DINO与IKK相互作用和稳定DNA损伤后的p53。lncRNAs也经常与调节mRNA加工和稳定性的RBP直接接触。热空气的作用是通过与hnRNPA2/B1，作为“媒介”将HOTAIR/PRC2靶向于mRNA转录。最近，发现了一种新的超保守的lncRNA-THOR，并证明它通过稳定IGF2BP1与靶mRNA的结合（图1C）。最后，lncRNAs可以作为核斑点和副斑点中调节分子的支架，这些lncRNAs以 NEAT1和MALAT1为典型。除蛋白质外，lncRNAs还可以直接与核酸结合，介导其分子作用机制。两个有趣的例子包括最近发现的lncRNA ARLNC1和LincRNA p21，前者与AR mRNA相互作用以调节其在前列腺癌中的细胞质水平，后者直接结合JUNB和CTNNB1转录物以抑制其翻译。另一个常见的机制是lncRNA作为竞争性内源性RNA（ceRNA）或miRNAs的“海绵”。H19是第一批被发现的lncrna之一，它可以作为多种肿瘤抑制miRNAs的诱饵，let-7就是一个显著的例子。TUG1已经被证明是前列腺癌中靶向PTEN的miRNAs的海绵，以及胶质瘤细胞中靶向SOX2和MYC的miRNAs。此外，还发现lncRNAs与DNA直接相互作用。转化生长因子β（TGF-β）途径相关基因的靶启动子中富含GA的基序通过RNA-DNA三重链的形成吸引富含GA的MEG3-lncRNA序列，而PRC2则通过与MEG3的相互作用被调节。考虑到广泛的调控机制和受影响的下游途径的多样性，通过体内实验发现许多lncRNAs，包括上面谈到的几个lncRNAs，是癌症调控的重要因素，并代表了可能的药物靶点，这一点并不为奇（表1）。由于物种保护的原因，这些研究大多依赖于在小鼠异种移植的人类癌细胞系中调节lncRNAs的表达。与miRNAs一样，lncRNAs也被发现作为肿瘤抑制因子、癌基因或表现出受环境影响而发挥不同的调节作用。许多lncRNA的细胞功能已经被阐明为促进肿瘤生长的癌基因，并且经常在癌症中过度表达。HOTAIR是研究最多的致癌lncRNA之一，最初被认为是HOX基因家族的调节因子，有助于控制细胞的特性然而，HOTAIR在通过靶向PRC2和LSD1/CoREST/REST控制基因抑制方面的更为全球性的作用很快被注意到。HOTAIR过度表达与乳腺癌和其他几种癌症的不良预后相关，可能是由于转移和肿瘤侵袭性增加。一些新的致癌基因lncRNAs仅在过去几年中被功能性描述过，包括THOR（图1C）和前面提到的ARLNC1，以及SAMMSON和EPIC1（表1），并且这个列表无疑将继续增长，SAMMSON在尤其是最近作为一种黑色素瘤特异性lncRNA，无论TP53、BRAF或NRAS突变状态如何，都是细胞生长和存活所必需的。从机制上讲，SAMMSON通过与p32、CARF和XRN2蛋白，有助于平衡核糖体RNA（rRNA）在细胞溶胶和线粒体中的成熟和蛋白质合成。重要的是，在病人来源的异种移植（PDX）模型中，GapmeR沉默SAMMSON抑制肿瘤生长，显示了这种lncRNA具有一定的治疗癌症的潜能。一些lncRNA通过阻止增殖、激活凋亡、维持基因组稳定性或促进肿瘤抑制因子的表达，起到预防癌症的作用。例如，MEG3是最具特征性的肿瘤抑制性lncRNA之一。除了调节TGF-β外，MEG3能够下调MDM2的表达，增加p53蛋白水平（图2B）；这些和其他途径的一起会导致细胞增殖的减少。与它作为肿瘤抑制因子的作用一致，MEG3的拷贝丢失及其启动子CpG甲基化增加也常见于癌症。GAS5是另一种已知的肿瘤抑制作用的lncRNA，通常在癌症中下调，在乳腺癌和胶质母细胞瘤模型中有直接的体内实验证据。除了影响GR信号外，GAS5还参与与miRNAs的相互作用，最终导致细胞增殖减少、凋亡增加以及迁移能力下降。许多lncRNA具有抑癌和致癌的双重功能。例如，在乳腺癌中，NKILA负性调节核因子ĸB（NF-ĸB）信号和下游炎症。在人类乳腺癌细胞系NKILA过度表达的小鼠异种移植模型中，可以转化为转移减少和生存率增加，表明其具有抑癌作用。然而，最近还发现，NKILA的增加可以通过激活诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和TH1细胞的细胞死亡来促进肿瘤免疫逃逸，发挥致癌特性。假基因是lncRNA转录子的一个亚类，其序列与编码基因相似，但已失活，不再产生功能蛋白。RNA-seq研究发现，全基因组中有数千个假基因表达，其中许多是特定癌症类型的特异性基因。虽然假基因有时被认为是无用的进化遗物，但研究表明，它们具有重要的功能，既可以预防癌症，也可以促进癌症的发展。假基因发挥作用的一种方式是充当诱饵，将miRNAs和其他分子从编码基因对应物中转移开。PTENP1假基因在大小和结构上与编码基因PTEN几乎相同，PTEN是一种强大的肿瘤抑制因子。当发挥正常功能时，假基因PTENP1可以作为海绵状miRNAs的诱饵，否则会减少PTEN的产生（图2C）。通过以这种方式作为ceRNA，PTENP1假基因起到抑癌作用（表1）。其他假基因ceRNAs也能够促进肿瘤生长。最近，在一个小鼠模型中，假基因BRAFP1的异常表达被证明会导致侵袭性B细胞淋巴瘤。当过表达时，假基因作为miRNA诱饵，增加BRAF蛋白的数量（图1D）。事实上，具有异常假基因的小鼠与具有蛋白质编码对应的BRAF癌基因的小鼠一样，也会迅速患上癌症，这表明假基因不仅不是“死亡”基因，而且可能直接导致癌症的发展。虽然这项研究才刚刚开始，但越来越清楚的是，假基因在生理和癌症方面的作用比以前人们所认识到的要更为强大。在lncRNA中还存在一类叫circRNAs，顾名思义，是单链共价封闭的RNA分子。这些分子通常是通过反剪接过程产生的，但circRNA生物形成的确切机制尚待完全阐明。然而，已有研究表明，circRNA的亲本基因表达不是circRNA表达的预测因子。与circRNAs相关的因素是侧翼内含子长度更长，内含子重复和反向补体成分增多。在过去的几年里，在细胞系中发现了一些circRNA的数据库，但是以直接鉴定临床样本中的circRNA为中心的研究只是最近才进行的。在一项研究中，使用临床肿瘤样本（2000+）对40多个肿瘤部位的circRNAs进行分析，并生成了MiOncoCirc数据库。值得注意的是，这些研究发现了超过160000个显著表达的circRNAs。最近的另一项研究显示，特别是在前列腺癌中，通过前列腺癌组织的RNA序列鉴定了76311个circRNAs。总体来说，这些研究表明circRNAs在癌症中的广泛存在。有趣的是，总的circRNA丰度已经被证明与细胞增殖呈负相关。尽管circRNAs广泛表达，但大多数作用机制和功能作用仍有待阐明。对于少数已经进行功能研究的circRNA，已经描述了类似于其他lncRNA的机制，以及作为癌基因或肿瘤抑制因子的功能（原文表1）。与lncRNAs一样，circRNAs作为一种作用机制也被认为是海绵状miRNAs，circCCDC66在结直肠癌中具有致癌作用，circHIPK3在膀胱癌中具有抑癌作用（图2D）。circRNAs与miRNAs的相互作用也可能起到稳定miRNA的作用，最近有研究表明，在前列腺癌中circCSNK1G3和miR-181可能与miRNA结合伙伴发生作用，从而促进细胞增殖。circRNAs还被认为可以直接与蛋白质结合，作为复杂组装的支架，如circCTNNB1和DDX3（图1E），或者海绵状的蛋白质，以防止其调节作用。值得注意的是，虽然研究者已经在ncRNAs中讨论了circRNAs，但是也有研究表明一些circRNAs可能被翻译。虽然对circRNAs的功能研究和治疗潜力的评估才刚刚起步，但很明显circRNAs具有增强的稳定性，使其成为新的癌症生物标记物的主要候选，这些下文将进一步讨论。在http://clinical trials.gov数据库中搜索与ncRNAs相关的关键词，可以发现数百个涉及ncRNAs的临床试验（表S1），其中许多是癌症试验，绝大多数是800多个涉及miRNAs的试验。鉴于ncRNAs检测方法的高度特异性及其组织特异性，以及发现研究中的大量支持数据，这些试验中的绝大多数都是诊断性的，ncRNAs被用作疾病状态的生物标记或疾病结局的预后标志。然而，鉴于最近基于RNAi和oligo的药物的成功，已经开始了一些ncRNA的治疗性临床试验，尽管成功率参差不齐。下面，研究者将重点介绍ncRNA诊断和治疗性癌症试验，这些试验目前正在进行，或刚刚完成，并且有可能影响患者的治疗。ncRNAs是一种有用的分子生物标记物，因为ncRNA的表达在不同的癌症中被观察到。临床前的大量研究表明，ncRNAs有望作为诊断和预后的生物标记物，其中突出的例子见于表2（原文），可以在miRNA和ncRNAs(lncRNAs、circRNAs)中发现明显的实例。尽管circRNAs的功能才刚刚开始被探究，但由于其对外核糖核酸酶具有共价封闭端的抗药性而增强了稳定性，因此它可以作为一类特别的生物标记物。重要的是，如表2所示，在血液或尿液中可以发现一些生物标记物，在这些地方获得的侵入性比获得肿瘤活检所需的侵入性小得多。特定生物标记物的表达可以检测出与正常样本相比的癌症存在，或者在发现癌症后预测生存、转移或治疗反应。在表2中列出的生物标记物中，PCA3是迄今为止第一个也是唯一一个获得美国FDA批准作为癌症生物标记物测试的ncRNA。PCA3是前列腺癌中经常高表达的前列腺特异性标记物，而且重要的是，可以通过非侵入性尿液采集很容易检测到。当结合尿TMPRSS2:ERG水平，前列腺癌中另一个转录物经常过度表达时，PCA3的诊断能力更强。随着数千个ncRNAs的表达数据可在疾病部位获得，现在识别新的单一生物标记物（如表2所示）或生物标记物组的潜力是无止境的。下面重点介绍的四项涉及引人注目的科学，是数百项以ncRNA相关的癌症生物标记物为中心的临床试验的例子。肺癌低剂量CT筛查中加入miRNA血液试验（NCT03452514）由Hummingbird Diagnostics谷歌算法诊断赞助并在哈佛医学院和Lahey Clinic进行的一项试验目前正在登记，以确定miRNA谱（Hummingbird专有的HMBDx）是否优于低剂量计算机断层扫描（LDCT）诊断肺癌的特异性。目标注册人数是400名符合肺癌筛查标准的参与者。在这里，抽血将用于在LDCT前筛查血清miRNA，并与至少12个月的随访后的未来结果相关。虽然CT对肺结节的检出能力很高，但仍存在假阳性和反复暴露于辐射的问题。能够使用一个简单的，非侵入性的基于血液的miRNA检测将是肺癌诊断的重要一步。在胶质瘤患者上检测miRNA-10b的表达水平(NCT 01849952)胶质母细胞瘤是最具侵袭性的肿瘤之一，迫切需要开发新的早期生物标志物和治疗靶点。如上所述，癌基因miR-10b在胶质母细胞瘤中高表达，是肿瘤生长所必需的。这项多部位临床试验由达特茅斯-希区柯克医学中心、塔夫茨医学中心、马萨诸塞州总医院和佛蒙特大学赞助并在该中心进行。该试验将检测原发性胶质母细胞瘤、血液和脑脊液中miR-10b的表达水平是否可以作为胶质母细胞瘤的预后和诊断指标。患者生存率、肿瘤分级和基因型变异将与200例胶质源性脑肿瘤患者miR-10b表达水平相关。“Dicer1-相关的胸膜肺母细胞瘤易感性综合征：一项自然史研究”（NCT01247597）这项大规模的观察研究，旨在招募1500名参与者，由国家癌症研究所（NCI）赞助。如上所述，Dicer1是一种核糖核酸酶，参与miRNA的生物合成途径。这次实验寻求确定与DICER1遗传突变相关的肿瘤和良性肿瘤的具体类型，特别是胸膜肺母细胞瘤（PPB），这是一种罕见的儿童肺癌。研究人员正在收集有关患有PPB或其他与PPB相关的罕见肿瘤的个人和近亲的进一步病史和遗传信息，以便更好地了解这种疾病。“上皮性卵巢癌外泌体中非编码RNA的检测”(NCT 03738319)本研究由北京协和医科大学附属医院主办，采用新一代测序技术，对160例高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和妇科良性疾病患者的血液标本进行miRNAs和lncRNAs的表达分析。将比较肿瘤组和对照组间miRNAs和lncRNAs的差异表达，并验证候选的ncRNAs作为卵巢癌检测和预后的生物标记物。这项试验的完成将有望带来有希望的临床ncRNA生物标记物，可用于帮助早期发现这种疾病，这种疾病通常直到晚期才被诊断出来。正如本综述中所讨论的，ncRNAs是重要的调控分子，可以驱动或阻止致癌过程（图1和图2；表1）。因此，开发有效的治疗方法来沉默（癌基因）或过度表达（肿瘤抑制因子）ncRNAs是近年来研究的一个活跃领域。体内抑制ncRNAs通常需要ncRNA的寡核苷酸靶向性和给药方法。对于需要过度表达的miRNA的靶向性，使用由miRNA双链组成的合成寡核苷酸（miRNA模拟物）。相反，为了抑制癌基因miRNA，采用单链反义RNA（ (antimiRs或者antagomiRs)）为了提高体内的稳定性和亲和力，常常对RNA药物进行化学修饰。常见的例子包括锁定核酸（LNA）修饰以锁定RNA的糖磷酸骨架的确认和核糖糖的2'-OH的替换，例如2'-O-甲基（2'-O-Me）或2'-O-甲氧基乙基（2'-O-MOE）修饰。除了优化靶向设计，RNA药物通常需要体内给药方法，其中以脂质为基础的纳米载体最为成熟，多肽和聚合物给药系统的新进展也正在开发中。通过反义寡核苷酸（ASO）等技术，lncRNA在体内可被抑制，从而导致靶lncRNA的RNase-H依赖性降解。还可以对lncRNA靶向ASO进行特定的化学修饰，以提高其稳定性，例如上述的LNA、2'-O-Me或2'-O-MOE、S-约束乙基（cEt）修饰，或“GapmeR”RNA-DNA-RNA杂交ASOs。这种优化甚至可以开发出下一代的ASOs，这种ASOs具有更高的效力，可以在体内自由吸收，而无需给药方法。迄今为止，大多数在癌症治疗中使用ncRNA靶向药物的研究都处于临床前阶段，但这些研究仍然强调了这一策略的应用前景。例如，在小鼠模型中基于ASO的lncRNA MALAT1缺失可能影响肺癌和乳腺癌细胞的生长和转移。接下来，研究人员将对已经完成的两个治疗性临床试验和一个已有初步报告结果的临床试验进行讲述，所有这些试验都以miRNAs为靶点。由于尚未完成直接针对其他类型ncRNAs的治疗试验，因此研究者讨论了在膀胱癌临床试验中利用lncRNA H19启动子的替代策略。随着研究技术的进步，人们肯定会看到更多基于ncRNA的治疗方法进入临床实验。MRX34、miR-RX34脂质体注射的多中心1期研究”（NCT01829971/NCT02862145）这项国际研究是由Mirna治疗学（现在的合成治疗学）赞助的，在美国和韩国的多个地点进行。它评估了MRX34对不能切除的原发性肝癌患者的安全性，选择有或者没有肝脏参与的晚期或转移性癌，或血液系统恶性肿瘤进行研究。该药物是一种脂质体miR-34模拟静脉给药。如上所述，miR-34是一种抑癌miRNA，是p53的直接靶点，能够调节多种癌基因的表达。47名患者接受药物和最大耐受剂量（MTD）的测定，而少数患者经历了部分反应。研究者认为MRX34具有一定的抗肿瘤活性，是安全的。不幸的是，在1b期多个患者经历了免疫相关毒性，一些患者经历了严重的（4级）细胞因子释放综合征，导致试验终止。由于试验的最终结果尚未公布，目前尚不清楚为什么这些患者经历严重的不良事件（SAES），但应该注意到，脂质纳米颗粒和小双链RNA都被报道可引起免疫毒性。一项临床试验（NCT 02716012）使用了相同的脂质纳米颗粒（称为Smarticle），但使用了来自MiNA Therapeutics的不同双链RNA（dsRNA）（靶向蛋白编码基因CEBPA），最近在2019年欧洲肿瘤医学会大会上研究者报告并没有出现严重不良。“MesomiR 1：针对复发性MPM和NSCLC患者的二线或三线治疗的1期研究”（NCT 02369198）这项研究由石棉疾病研究基金会和Engenic有限公司赞助，在悉尼大学进行，评估了复发性恶性胸膜间皮瘤（MPM）和非小细胞肺癌（NSCLC）患者靶器官的MTD。静脉注射的靶向药物是一个含有双链23碱基对的小细胞，它是基于抑癌miR-16合成的miRNA模拟物（图2A）。该药物载体是由非活的细菌小细胞被靶向的抗EGFR抗体包被而成。这个特异性靶向颗粒及其miRNA负载到表达EGFR的癌细胞。共有26例患者接受靶向治疗，测定MTD。一位患者对治疗表现出部分反应，这使得研究者得出结论，他们的研究支持进一步的试验，也许得与其他目前的疗法相结合。MRG-106对MF、CLL、DLBCL或ATLL患者的安全性、耐受性和药代动力学研究(NCT 02580552/NC) (T 03713320)这项研究由miRagen疗法公司赞助，在美国和加拿大的多个地点进行，目的是评估cobomarsen（也称为MRG-106）对诊断为淋巴瘤和白血病的患者的安全性和潜在疗效。cobomarsen是一种LNA，旨在抑制miR-155的活性（图1A），miR-155是一种致癌的miRNA，在这些类型的癌症中含量很高，对MF癌细胞的生长和存活很重要。在2018年提交给美国血液学会的初步结果中显示，无论是肿瘤内治疗还是系统治疗，43名患者对cobomarsen具有良好的耐受性。此外，一些患者有持久的部分反应。Codex：在无反应的非肌层浸润性膀胱肿瘤接种Vixte质粒（BC-819）的研究(NCT03719300)H19是一种lncRNA，具有多种致癌作用机制，在不同类型的癌症中经常上调。由于其在癌细胞中的上调，研究人员利用其启动子传递下游序列的癌特异性表达。一种化合物，BC-819（也称为DTA-H19），是在H19启动子的调控下表达白喉毒素A（DTA）的DNA质粒，作为与聚乙烯亚胺（PEI）的复合物递送。BC-819已经完成了胰腺癌、卵巢癌和膀胱癌的1/2a期试验，目前的临床研究主要集中在膀胱癌上，H19通常在正常细胞中被抑制，但在肿瘤细胞中上调。这项由Anchiano Therapeutics赞助的第2阶段多部位试验将检查140名对标准治疗卡介苗（BCG）治疗无效的非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）患者。BC-819将直接注入膀胱，并在整个研究过程中评估临床疗效的几个指标。虽然不直接针对ncRNA，但这是一个有趣的例子，说明了如何利用ncRNA的特性，如H19癌特异性表达，进行新的癌症治疗干预。展望未来，研究人员和临床医生可能会发现ncRNAs更多的分子特征，帮助疾病诊断和区分恶性组织和良性组织，以及一种癌症或另一种癌症。这些检测也可能被用于确定预后，如确定转移风险或对化疗或治疗等有反应的可能性。尽管治疗应用仍处于早期阶段，但基于涉及癌症途径的ncRNAs的药物仍有望在有一天被用于癌症患者。对于识别候选的生物标记物或治疗靶点，专注于谱系和疾病特异性ncRNAs似乎是理想的方法，就像上述前列腺癌中PCA3一样。基于ncRNA的表达水平也是进行诊断和治疗的关键因素。如前文所述，与蛋白质编码基因相比，lncRNAs的表达水平通常较低，因此识别那些容易被检测到的候选基因非常重要。此外，在尿液或血液中发现的诊断性生物标记物的研究是比较理想的，这样就可以避免患者进行通常与组织收集相关的非侵入性操作。与生物制剂或小分子相比，基于RNA的治疗方法具有重要的优势和挑战，应予以考虑。RNA药物是基于核苷酸杂交的，因此目标很容易接近；人们只需要确定序列并测试候选的活性。对于小分子或生物制品，必须采用较长且费力的或基于结构的设计方法。有可能基于RNA的设计方法，可以很容易地设计出针对多种RNA的组合。尽管有这些优势，但是必须考虑和优化RNA药物的给药方法，这通常是一个具有挑战性的过程。与小分子和生物制剂相比，口服制剂对于基于RNA的疗法也更为困难。如上所述，还存在与免疫相关毒性和其他基于RNA的药物的不良反应等有关的问题。在未来的研究中，不断改进寡核苷酸的化学和传递方法以缓解这些问题。最后，小分子药物的成本可以大大低于基于RNA的药物。研究者同时也指出相关的研究者可查阅有关前两段主题的最新评论（及其中的参考文献），以供进一步讨论。研究小组的成员最近展示了利用病人源性器官(PDO)和异种移植(PDX）在单个癌症患者的肿瘤中被上调的靶向性oncomiRs的潜力，这开辟了研究个性化RNA药物的可能性。目前，每个癌症患者都被分配到一个专门的护理团队，该团队由一名专业的肿瘤外科医生、医学肿瘤学家、放射肿瘤学家和病理学家组成。不难想象，肿瘤委员会会在每个癌症患者的护理标准中增加一个完整的ncRNA工作流程。这可能包括以下组成部分：对癌症患者的肿瘤和血清完整的RNA序列（包括ncRNAs）；对肿瘤和生殖系基因组完整的全基因组序列；一项综合生物信息学和病理学分析，用于量化患者癌症中的恶性病理表型，并确定显著改变的基因组和ncRNA改变；一份病理报告，包括对肿瘤病理学、DNA和RNA数据以及潜在治疗弱点的解释，将在肿瘤委员会上提出，以帮助作出正确的治疗决定；PDO和PDX模型生长和在PDO和PDX上测试的治疗方法（例如，传统药物测试和以RNA图谱为中心的基于ncRNA的药物筛选）；可能基于ncRNA的治疗建议；病人的DNA/RNA和预后数据的可搜索文件，放在病人的电子病历中，以便在必要时以及在知道其他ncRNA信息时进行再分析。ncRNAs的发现揭开了医学史上的新篇章，它有望彻底改变癌症和其他疾病的诊断和治疗方式，而人类也在刚刚开始揭开这个新的篇章。
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