科研 | 国人作品：转录组揭示连作土壤中施用土壤修复剂后的草莓根部恢复策略
编译：月中霜，编辑：十九、江舜尧。
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背景：草莓连作障碍在种植过程中严重威胁着草莓的产量。该实验室自主发明的一种土壤修复剂（SA）可以有效缓解草莓连作障碍，但是其作用原理目前尚不清楚。
结果：本研究主要将施用和未施用土壤修复剂的草莓根部进行转录组测序，从而揭示土壤修复剂处理后草莓根内的基因表达变化。结果显示，总共检测到188个差异基因，其中包括144个上调基因和44个下调基因。土壤修复剂处理后导致的基因表达变化主要集中在营养转运相关基因的上调表达和防御相关基因的下调表达。这些表现可以总结为连作土壤中施用土壤修复剂后，草莓根部产生的自身恢复策略的一种可能机制。同时，研究人员还发现涉及植物防御相关的9个热激蛋白均发生下调。
结论：本研究显示，当土壤修复剂缓解连作土壤所造成的胁迫后，草莓植株会重新分配自身资源，由防御转向生长。本研究为揭示草莓自身生长-防御平衡策略的基本机制提供了一个新思路。
论文ID
原名：Transcriptomic analysis reveals recovery strategies in strawberry roots afterusing a soil amendment in continuous cropping soil
译名：转录组揭示连作土壤中施用土壤修复剂后的草莓根部恢复策略
期刊：BMC Plant Biology
IF：3.670
发表时间：2020.01
通讯作者：刘奇志教授
通讯作者单位：中国农业大学植物保护学院
DOI号：10.1186/s12870-019-2216-x
实验设计
作者实验室发明一种具有自主知识产权的连作土壤修复剂，可以有效缓解草莓连作障碍，提高草莓产量。作者利用转录组技术，主要比较施用和未施用土壤修复剂后草莓根部转录水平变化，探究施用土壤修复剂后草莓根部自身恢复策略。另外作者通过q-PCR测定关键基因的表达变化，以进一步验证转录组数据的准确性。
结果
1.土壤修复剂对草莓生长的影响
草莓根和地上部分的长度和鲜重均受到土壤修复剂的影响（图1）。施用土壤修复剂后，草莓根长和地上部分长度显著增加10.37%和8.8%（图1a-b），而根和地上部分的鲜重分别显著增加27.17%和21.17%（图1c-d）。
图1 土壤修复剂对连作草莓植株生长的影响
2.差异表达基因的鉴定
为了获取草莓根部基因表达的整体数据，本文总共构建了6个转录本文库。其中每个数据库产生超过25,000,000的干净读数，Q30超过91.5%。超过72%的干净读数可以匹配到一个独特的位置或多个基因组位置。研究人员的目的是寻找不同数据库之间差异表达基因的整体变化。该研究中，总共有188个差异基因，包括144个上调基因和44个下调基因（图2）。
图2 连作和连作添加土壤修复剂之间差异基因表达分析。
3.差异表达基因的功能分类
为了进一步研究差异表达基因所发挥的主要功能，研究人员利用GOseq进行GO富集分析。本研究中，103个差异基因可以注释到GO富集分析中，主要分为以下三个主要部分：生物过程、细胞组分和分子功能。大多数DEGs 聚集到生物过程中的代谢过程、细胞过程、单个有机体、刺激反应、生物调节和定位（图3a中的红色部分）；细胞成分中的细胞、细胞部分、细胞器和细胞膜（图3a中的绿色部分）；分子功能中的催化活性和结合部分（图3a中的蓝色部分）。
进一步将差异基因富集最显著的前20的GO富集信息进行GO分析（p值<0.05），如图3b，c所示。在上调的基因中，大多数基因富集到营养运输相关的GO术语，如生物过程中的铵跨膜转运（GO：0072488）和钾离子输出（GO:0071435）；分子功能中的钙依赖性磷脂结合（GO:0005544），铵跨膜转运载体体活（GO:0008519）和营养存储活性（图3b）。
与营养运输有关的差异基因详见表2，其中包括2个铵转运蛋白3，2个钙磷脂结合蛋白和2个发芽素蛋白基因。其他上调的DEGs被分配到不同的GO术语中，例如生物过程中的催化活性的负调节（GO:0043086）、甘油-3-磷酸生物合成过程（GO:0046167）、叶黄素分解代谢过程（GO:0016124）和胡萝卜素分解代谢过程（GO:0016121）；分子功能中的相同蛋白质结合（GO:0042802）和丝氨酸型羧肽酶活性（GO:0004185）；和细胞成分中的类囊体（GO:0009579）中。比较有趣的是，其中的三个，叶黄素分解代谢过程（GO:0016124），胡萝卜素分解代谢过程（GO:0016121）和类囊体（GO:0009579）三个GO 术语均与植物光合作用有关。在下调的基因中，许多差异表达基因富集到防御相关的GO术语中，例如生物过程中的过氧化氢的反应（GO：0042542），光敏反应（GO:0009644），细菌相关防御反应和不相容的相互作用（GO：0009816），水缺乏的反应（GO：0009414），热激反应（GO：0009408），氧化应激反应（GO：0006979），和病毒反应（GO：0009615）以及分子功能中的过氧化物酶活性（GO:0004601）（图3c）。
利用KOBAS 2.0进行KEGG富集分析来揭示常见的组织特异的表达模式。差异表达基因的KEGG通路富集可主要分为五大类：细胞过程、环境信息处理过程、遗传信息处理、代谢和组织系统。在最显著富集的通路中，9个DEGs与内质网中的蛋白质加工（ko04141）有关；5个DEGs被分配到遗传信息处理中的剪接体（ko03040）中；4个DEGs与细胞过程中的内吞作用（ko04144）有关；4个DEGs与代谢中的脂肪酸代谢（ko01212）有关；3个DEGs富集到组织系统中的植物-病原相互作用（ko04626）通路（图4）。
4. Hsp家族基因参与草莓恢复策略
研究人员通过分析差异表达基因中的蛋白结构域以预测各个差异基因所发挥功能（图5a）。结果显示激酶、热休克蛋白、转运体和简单重复蛋白的数量最多。前人研究表明Hsp家族蛋白在不同胁迫下的植物耐受机制中起着重要作用。在该研究中，在所有差异表达基因中总共发现有9个热激蛋白。通过构建进化树发现9个Hsp基因分别属于Hsp83（c120601.graph_c0，c112416.graph_ c1），Hsp90（c12447.graph_c1），Hsp70（c118039.graph_c0），Hsp22（c112483.graph_c0）HspST1（c120543.graph_c0），和Hsc70(c65539.graph_c0, c112581.graph_c1, c126335.graph_c0)（图5b）。
研究人员通过分析这9个Hsp家族基因的表达模式来预测它们在土壤修复剂施用后的反应。热图结果显示，当连作土壤中施用土壤修复剂之后，9个Hsp家族基因均发生显著下调（图5c）。另外，将这9个基因通过KEGG富集分析发现，除HspST1（c120543.graph_c0）外，其余8个基因都参与内质网中的蛋白质加工过程（图6b）。2个Hsc70基因富集到剪接体和内吞通路，Hsp83/90基因则参与植物病原相互作用通路（图5d）。
通过对Hsp蛋白进行蛋白互作分析，进一步了解其调控机制。其中5个Hsp蛋白质（Hsp70、2个Hsp83s、Hsp90和HspST1）之间存在互作现象（图5e）。另外，互作网中的6个蛋白同时富集到内质网中的蛋白质加工过程和植物-病原相互作用通路中（图5e中以红色和蓝色圆圈表示）。
5. 实时定量PCR验证基因表达模式
为了验证转录组测序结果，研究人员选择5个Hsp家族差异表达基因进行qPCR检测，包括Hsp22（c112483.graph_c0）、Hsp70（c118039.graph_c0）、Hsp83（c120601.graph_c0）、Hsp90（c124547.graph_c1）和HspST1（c120543.graph_c0）（图6）。qRT-PCR结果显示，这5个Hsp基因在CC+SA的根中均显著下调。此外，连作土壤中施用土壤修复剂后，草莓根中几乎检测不到Hsp70和Hsp83的表达。qPCR数据与转录组测序结果相一致，表明转录组测序结果可靠。
讨论
本研究通过转录组的差异表达分析确定了连作土壤施用土壤修复剂后，草莓根系中基因表达模式的变化。施用土壤修复剂后，草莓根部营养转运相关基因显著上调，防御相关基因显著下调。这些结果表明，当连作土壤中施用修复剂后，草莓植株重新分配自身资源，将更多的资源分配给生长所需，有助于植株的生长。9个下调的Hsp基因主要参与到植物防御相关通路，如内质网蛋白质加工过程、内吞作用和植物-病原相互作用等，该结果揭示了连作土壤中施用土壤修复剂后草莓植株可能的自身恢复策略。本研究的结果为进一步研究植物生长-防御平衡策略提供了重要的理论依据。
讨论
草莓连作障碍严重威胁着草莓的可持续发展。随着日益增长的草莓市场需求，寻求可以有效解决草莓连作障碍的耕作模式显得越来越重要。研究者实验室经过多年努力，研发出一种具有自主知识产权的连作土壤修复剂，可以有效缓解草莓连作障碍。此前的研究主要集中在该修复剂相关的宏观研究。为了进一步了解草莓本身基因所发生的变化，为以后更加深入的机理研究做好铺垫，开展本次研究。通过转录组测序结果发现，当连作土壤中施用修复剂后，草莓植株重新分配自身资源，通过降低自身防御，增加根部营养吸收，从而更加有助于草莓植株生长。本研究的结果为进一步研究植物生长-防御平衡策略提供了重要的理论依据。
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