科研 | Am J Cancer Res：苄索氯铵通过诱导p38介导的cyclin D1降解而抑制肺癌的发生（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Emma、江舜尧。
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肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，但有效的治疗方法有限。这项研究的目的是从美国食品和药物管理局(FDA)批准的包含528种化合物的药物库中确定新的抗癌策略。苄索氯铵(BZN)是一个FDA批准的抗感染药物，明显诱导肺癌细胞凋亡和抑制肺癌细胞的增殖和克隆形成能力，BZN还增强了肺癌细胞对吉非替尼的敏感性，吉非替尼是特定肺癌患者的一线治疗策略。此外，BZN通过增加细胞凋亡和降低Ki-67增殖指数，显著延缓了裸鼠移植瘤的生长，对动物重要器官无明显毒性作用。定量蛋白质组学结合生物信息学分析和一系列功能分析表明，BZN诱导细胞周期停滞在G1期，这与p38介导的苏氨酸286位(T286)磷酸化的增加和cyclin D1的加速降解有关。我们首次证明BZN可能是一个有前途的治疗肺癌的药物。
论文ID
实验设计
1. 药物库筛选抗癌药物；
2. 体外验证药物的抗癌作用；
3. SILAC定量蛋白质组学和IPA通路分析寻找药物抗癌的作用机制；
4. 验证药物抗癌的作用机制；
5. 体内验证药物的抗癌作用。
实验结果
1. 通过FDA批准的药物库鉴定潜在的抗癌药物
为了从用于其他疾病的传统药物中筛选新的抗癌化合物，我们利用了由528种FDA批准的药物组成的化合物库。528种化合物或DMSO对照处理A549细胞48小时，监测细胞存活率，以确定各种药物对NSCLC细胞增殖的影响(图1A)。如图1A所示，共有11种药物对癌细胞生长有明显的抑制作用(> 50%)(表S1)，其中包括临床常用的癌症治疗药物表阿霉素和氟达拉滨，提示我们的筛选策略可以用于识别具有抗癌作用的新化合物。在这11个候选药物中，BZN(图1B)是一种著名的抗真菌和抗菌化合物，而并没有与肺癌治疗相关，这引起了我们对其进一步研究的兴趣。
2. 苄索氯铵抑制肺癌细胞增殖
为了研究BZN对肺癌细胞的增殖抑制作用，我们将不同浓度的BZN处理A549和H1299细胞72 h，如图1C所示，BZN以剂量和时间依赖性显著抑制细胞活力。此外，我们还进行了克隆形成实验，以进一步确定BZN对肺癌细胞生长的影响，结果表明，BZN显著降低A549和H1299细胞克隆形成能力(图1D)，表明BZN强有力地抑制肺癌细胞增殖。
3. 苄索氯铵诱发肺癌细胞凋亡
接下来我们采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测BZN是否对肺癌细胞凋亡有影响。流式细胞仪数据显示，BZN处理的A549和H1299细胞凋亡百分比呈剂量依赖性增加(图1E)。在A549和H1299细胞中，观察到BZN处理后caspase-3和PARP的活性形式cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表达均显著增加(图1F)，证实BZN在肺癌细胞中可以诱导细胞凋亡，抑制细胞生长。
图1 苄索氯铵(BZN)抑制肺癌细胞增殖
A) 分别用528种FDA批准的药物处理A549细胞，用WST-1法测定细胞活力；B) BZN结构图；C) WST-1检测不同浓度BZN处理A549和H1299细胞72 h后的细胞存活率；D) 用BZN分别处理A549和H1299细胞后的克隆形成能力；E) BZN分别处理A549和H1299 48 h，流式细胞术检测凋亡细胞；F) Western blot检测caspase-3、cleaved caspase-3、PARP和cleaved PARP表达水平。
4. 定量蛋白质组学提示细胞周期阻滞参与了苄索氯铵在癌细胞中的作用机制
为了研究BZN抗癌的作用机制，利用SILAC定量蛋白质组学识别BZN治疗肺癌细胞的差异表达蛋白质，分别用10 μM BZN和DMSO处理轻链标记和重链标记的A549细胞48 h，然后溶解和混合产物进行质谱(MS)分析(图2A)，共鉴定和量化了5123个蛋白，其中3010个蛋白均在3个重复样本中被检测到(图2B)。共有239个蛋白被发现明显受BZN调控(表S2)，包括60个上调蛋白和179个下调蛋白(图2C)，上传到IPA信号通路分析，发现239个蛋白可能参与其功能特性。结果表明，细胞周期在预测的前5个典型通路中排名第一(图2D)。为了证实这一预测，我们通过流式细胞术测定了BZN处理的A549和H1299的细胞周期分布，数据显示BZN诱导的细胞周期明显阻滞在G1期(图2E)。综上所述，这些数据表明BZN可能影响G1期向S期转变的过程，从而抑制肺癌的肿瘤发生。
图2 定量蛋白质组学提示细胞周期阻滞参与了苄索氯铵在癌细胞中的作用机制
A) SILAC定量蛋白质组学鉴定BZN调控蛋白的实验过程；B) 维恩图显示三个生物重复中识别重叠的蛋白；C) BZN处理的A549细胞中，fold change≥1.5且p≤0.05的差异表达蛋白；D) IPA分析BZN处理细胞中差异表达蛋白的前五个典型途径；E) A549和H1299细胞用BZN(20 μM)处理48 h，流式细胞仪检测细胞周期分布。
5. 苄索氯铵通过泛素-蛋白酶体途径加速cyclin D1蛋白降解
为了进一步探讨BZN诱导G1细胞周期阻滞的分子机制，我们采用Western blot方法检测了G1细胞周期几个关键调控因子的表达水平。如图3A所示，cyclin D1、cyclin E1、CDK4和CDK6表达下降，Cyclin D1是细胞周期蛋白G1期最敏感和重要的蛋白，因此我们关注BZN对cyclin D1的调控。
接下来我们研究了BZN是否会影响cyclin D1的蛋白降解。在肺癌细胞中，利用免疫沉淀实验验证有或没有BZN治疗对cyclin D1泛素化的影响，发现在A549和H1299中cyclin D1的泛素化显著增加(图3B)，说明BZN治疗加快了cyclin D1蛋白的降解。此外，用蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)预处理12小时后，再用10 μM BZN处理细胞，在指定的时间点收集细胞裂解液，用Western blot比较cyclin D1的表达。如图3C所示，与对照组相比，BZN处理的肺癌细胞中cyclin D1蛋白的降解速度加快，说明BZN治疗会导致癌细胞中cyclin D1蛋白的降解。此外，BZN对cyclin D1表达的抑制作用可被蛋白酶体抑制剂MG132逆转(图3D)，这有力支持BZN通过促进泛素介导的cyclin D1蛋白酶体降解而诱导G1期细胞周期阻滞。
图3 苄索氯铵通过泛素-蛋白酶体途径加速cyclin D1蛋白降解
A) Western blot比较BZN处理A549和H1299细胞G1期特异cyclin和CDK蛋白的表达水平；B) 对BZN处理的肺癌细胞进行免疫共沉淀，检测cyclin D1泛素化的表达水平；C) 50 μg/mL CHX预处理A549和H1299细胞12 h，然后用10 10 μM BZN治疗，在指定时间点收集细胞裂解液，用Western blott比较cyclin D1的表达情况；D) MG132可挽救BZN对cyclin D1表达的抑制作用。
6. 苄索氯铵激活p38信号通路，使cyclin D1的T286位磷酸化
Cyclin D1的T286位和T288位是影响其稳定性的关键因素。p38和ERK2也通过磷酸化T286位调控cyclin D1的稳定性，而T288的磷酸化是通过mirk/Dyrk1b调控的。因此，我们检测了BZN处理后T286和T288残基的磷酸化水平，数据显示T286磷酸化水平升高，而T288磷酸化水平没有变化(图4A)。BZN治疗肺癌细胞后明显调控p38的磷酸化，但不调控ERK2的磷酸化(图4B)，这些结果表明BZN可能通过激活p38的T286磷酸化而增加cyclin D1的泛素化降解，从而抑制肺癌细胞的生长(图4C)。
图4 苄索氯铵激活p38信号通路，使cyclin D1的T286位磷酸化
A) BZN处理A549和H1299细胞后，比较p-cyclin D1 T286和p-cyclin D1 T288的表达。B) BZN显著增加p-p38，但不改变p-ERK；C) 概述BZN抑制肺癌细胞增殖机制的示意图。
7. 苄索氯铵使肺癌细胞对吉非替尼敏感
鉴于BZN可诱导G1期细胞周期阻滞，我们推测它可作为一种药物增敏剂用于癌症治疗。吉非替尼是治疗EGFR突变的非小细胞肺癌患者的著名标准治疗方法，不幸的是，大多数患者由于耐药性不可避免地复发。在这里，我们检测了BZN与吉非替尼联合是否能产生协同效应，提高治疗效果。如图5A所示，尽管低剂量的BZN或吉非替尼对肺癌细胞的生存能力没有影响或影响不大，但BZN和吉非替尼联合使用后更强地抑制肺癌细胞的增殖，且明显抑制克隆形成能力(图5B)。此外，与BZN或吉非替尼单独处理相比，低剂量BZN与吉非替尼联合使用可显著诱导肺癌细胞凋亡(图5C)。由此说明，BZN可以提高肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。
图5 苄索氯铵使肺癌细胞对吉非替尼敏感
A) A549和H1299分别用DMSO、BZN(5 μM)、吉非替尼(5 μM)或BZN和吉非替尼联合处理72 h，用WST-1法测定细胞存活率；B) 克隆形成实验显示，BZN显著提高了肺癌细胞对吉非替尼的敏感性；C) 流式细胞技术检测DMSO、BZN、吉非替尼或联合用药处理的细胞凋亡百分比。
8. 苄索氯铵在体内抑制肿瘤生长
接下来我们评估了BZN在裸鼠中的治疗潜力。对裸鼠腹腔注射或口服BZN，监测肿瘤体积和小鼠体重，结果显示，BZN显著抑制了肿瘤的生长(图6A、6B)。我们测定了移植瘤的Ki-67增殖指数，结果显示BZN通过降低细胞增殖来抑制肿瘤生长(图6C)。如图6D所示，western blot分析显示，在BZN处理的异种移植瘤中，p-p38、p-Cyclin D1和cleaved-caspase-3表达上调(图6D)，这与体外实验结果一致。此外，治疗组与对照组小鼠体重无显著变化(图6E)。肺、肝、肾等重要器官的组织学检查未见明显的形态学改变(图6F)，说明BZN在体内具有抑制肿瘤生长和低毒性的作用。
图6 苄索氯铵在体内抑制肿瘤生长
A) 对照组和BZN治疗组肿瘤图像；B) BZN抑制A549来源的异种移植瘤生长的肿瘤曲线(n = 6)；C) BZN治疗异种移植瘤的Ki-67增殖指数的免疫组化分析；D) Western blot比较BZN和空白处理的异种移植瘤中p-cyclin D1 T286、cyclin D1、p-p38、p38、caspase-3和cleaved-caspase-3的表达水平；E) 实验期间裸鼠体重；F) HE染色治疗组和对照组的肺、肝脏和肾脏。
讨论
新药的发现是一个长期的过程，需要大量的投资，同时也面临着各种未知的风险。由于近年来临床药物开发的成功率非常低，人们逐渐认识到，对现有药物的新适应症进行识别，可能是开发新型抗癌试剂的一种相对低成本和高效的途径。米非司酮(MIF)是一种经常用于堕胎的药物，据报道对多激素依赖性癌症，包括管腔型乳腺癌有抗肿瘤活性。塞来昔布是一种治疗类风湿性关节炎的药物，已报道抑制皮肤鳞状细胞癌细胞(CSCC)的迁移。在本研究中，我们首次证明BZN，一种FDA批准的抗感染药物，可以诱导肺癌细胞凋亡，抑制增殖和肿瘤发生。事实上，我们的发现被最近的研究证实，BZN可以激活内质网(ER)应激，减少头颈部癌(HNSCC)的增殖。国家癌症研究所/NIH开发治疗项目对60种人类癌细胞株的研究显示，BZN具有广泛的抗肿瘤活性。然而，关于BZN在肺癌中的应用尚无相关研究。我们的研究提示BZN可能是一种很有前途的肺癌治疗药物。
体外研究发现，不断增加的治疗药物可诱导cyclin D1降解。Cyclin D1是细胞周期进程的重要调控因子。Cyclin D1与其结合伙伴CDK4和CDK6形成活性复合物，通过磷酸化和灭活Rb，促进G1进入S期。Cyclin D1在多种癌症中经常出现过表达，并与癌症的发生发展密切相关。Cyclin D1是一种非常不稳定的蛋白，半衰期短，提示增强Cyclin D1蛋白降解可能为治疗干预提供一种有效的策略。先前的研究表明，泛素特异性蛋白酶2(USP2)是一种稳定cyclin D1的特异性去泛素酶，敲低USP2可以使cyclin D1失稳并诱导人类癌细胞生长停滞。此外，cyclin D1的消融可以阻断具有激活的Neu-Ras通路的人类乳腺癌的生长。在本研究中，我们证明了BZN可以抑制肺癌的发生。在本研究中，我们证明了BZN可以抑制肺癌的发生。机制上，BZN处理激活p38信号通路，使cyclin D1在T286位点磷酸化，增强泛素与cyclin D1的相互作用，从而促进cyclin D1降解，诱导细胞周期阻滞，抑制癌细胞增殖。我们的研究结果进一步支持cyclin D1作为癌症治疗靶点的理论基础。
肺癌是一种致命的疾病，在所有癌症中死亡率最高。表皮生长因子受体(EGFR)过度表达或突变是NSCLC发生发展的重要原因。吉非替尼是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，已经被证明可以显著改善患者的预后和广泛应用于治疗晚期EGFR突变的非小细胞肺癌患者。不幸的是，由于耐药性，大多数患者不可避免地会复发。因此，提高吉非替尼治疗的疗效迫在眉睫。在本研究中，我们发现BZN与吉非替尼联合应用可显著诱导肺癌细胞凋亡，并对细胞增殖具有更强的抑制作用(图5)。我们的结果提示BZN是一种很有希望提高吉非替尼在非小细胞肺癌中疗效的药物。