综述 | Curr. Opin. Cell Biol. ：利用基于质谱的蛋白质组学分析细胞间信号转导
编译：彭翰林，编辑：Tracy、江舜尧。
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生理功能依赖于许多不同类型细胞的相互协调。蛋白质是细胞间的主要信号分子，然而它们在生理相关背景下的全面研究仍然具有一定挑战性。以质谱(MS)为基础的鸟枪蛋白质组学是一个系统分析蛋白质介导的细胞间信号转导和翻译后修饰的强大技术。这篇文章讨论了以细胞生物学、化学和生化MS为基础的方法来构建细胞信使、细胞表面受体及其相互作用图谱的研究进展，以及针对细胞界面动态信号转导机制研究的方法。基于MS的蛋白质组学为鉴定疾病中失调的细胞间信号通路提供了独特的系统生物学视角。
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内容
1. 引言
细胞与邻近细胞通过和细胞外环境交换信息，来协调组织发育到保护性免疫等多个生理过程。细胞间的通讯依赖于不同种类的生物分子，其中蛋白质在信号的传输和接收中发挥着重要的作用。作为复杂多细胞行为的关键因素，细胞间信号蛋白是食品和药物管理局批准药物的最大靶群。因此，了解细胞间信号蛋白的细胞和环境特异性不仅有助于研究者们理解后生动物生物学，而且有助于发现疾病相关的信号通路并开发相应的药物靶点。
分泌蛋白和细胞表面蛋白经过多个加工步骤来确定其细胞定位、结构和活性。不同蛋白质存在形式（proteoforms，遗传变异，剪接和翻译后修饰引起）有不同的功能，因此，蛋白水平上的直接信息对于评估蛋白介导的细胞间信号转导至关重要。抗体为基础的方法已经被研究者广泛应用来定量蛋白质，比如酶联免疫吸附测定，细胞检测珠阵列，以及流式细胞术和质谱流式细胞术。尽管抗体允许对高敏感性和高通量的蛋白质进行定量，但抗体的可用性、成本和不同的特异性限制了它们在全系统研究中的普遍适用性。
近年来，基于MS的蛋白质组学已成为全面定量蛋白质方面的重要技术。现代仪器及计算分析平台能够在不到一小时的时间内从单个样本中识别数千种蛋白质，为系统生物学研究提供了所需的深度和通量。因此，基于MS的蛋白质组学对生物医学研究产生了重大影响。基于MS的蛋白质组学能够检测蛋白质形态，例如检测蛋白序列中共价修饰的氨基酸，因此也成为翻译后修饰(PTMs)等步骤的重要探索技术。虽然基于MS研究细胞内信号转导机制的方法已得到广泛应用，但由于各种各样的技术挑战，细胞间信号传导的系统研究仍较少，主要原因有富含蛋白质的生物基质中分泌信使蛋白浓度低，膜蛋白的两亲性阻碍了蛋白的高效提取，以及细胞界面上的蛋白质相互作用较弱等。
最近发展起来的细胞、化学和生化技术使细胞间信号可以通过蛋白质组学进行系统水平的研究。在这里我们讨论了基于MS的鸟枪蛋白质组学策略来描述细胞间信号转导的工作步骤，从源细胞释放信息实体(如分泌蛋白)到靶细胞接收实体(如细胞表面的受体)，强调了基于MS的方法是如何在异质细胞系统中探明细胞间的动态信号转导和双向细胞特异性信号传导机制(图1)。
图1 基于MS的蛋白质组学策略概述
细胞间信号分析可以使用不同的细胞和生化策略，包括(1)细胞外空间的细胞间信号蛋白，(2)细胞表面的细胞间信号蛋白，(3)信号蛋白的相互作用，和(4)异质细胞系统中的细胞间信号
2. 细胞外空间的细胞间信号蛋白
单个细胞类型的全部分泌蛋白(称为分泌体)通常由数百个信使蛋白组成。利用质谱对分泌体进行全面的表征可以揭示传递到邻近或远端细胞信号的复杂动态变化，并有助于发现细胞非自主过程的关键驱动因素。此外，这种方式还可以检测到不同分泌蛋白的蛋白质形式，揭示不同蛋白质的生物活性。然而，体内许多信号蛋白（如细胞因子）在非常低的浓度下就可被检测到，而在初级体液或含血清补充剂的体外实验中，基于MS的分泌信号蛋白检测受到生物基质中高度丰富蛋白存在的阻碍，因此研究者们选择了合适的方法绕过这一问题来研究细胞外空间中的细胞间信使（表1）。
表1 基于MS的研究细胞外空间的细胞间信号蛋白的蛋白组策略
资源密集型生化分馏法可以提高对蛋白质丰富生物基质中低丰度蛋白的检测。在体外进行全面分泌组学分析的主要策略是在无血清培养基中培养细胞，确定相应的时间段来降低样品的复杂性。由于血清缺失可以改变细胞生理，无血清的分泌组学实验需要仔细优化培养时间和补充特定的生长因子、激素和表面活性剂，以最大限度地减少饥饿产物。如果不能实现血清饥饿，基于代谢标记和click化学兼容氨基酸的策略也可作为替代方案，例如azidohomoalanine (AHA)在体外可以被添加到血清补充培养基中，作为甲硫氨酸代孕物与新生蛋白结合，然后从细胞上清中富集AHA标记的分泌蛋白。维持高细胞存活率对于分泌组学实验来说至关重要，因为区分“真正”分泌的蛋白质和从死亡细胞中泄漏的蛋白质是一个挑战。大多数分泌蛋白通过ER-高尔基依赖的分泌途径进行加工，但分泌组学对于发现不是通过传统途径的细胞间信号是很强大的，如类似IL-1B的细胞因子，损伤相关的分子模式（HMGB1）或细胞表面受体（如IL-4Ra）的外结构域。
3. 细胞表面的细胞间信号蛋白
质膜蛋白在细胞间信号转导中充当配体和受体。因此，细胞表面的蛋白质组成控制着通过细胞-细胞直接接触传递的信息，并决定了哪些信号可以被细胞接收。质膜蛋白在细胞蛋白中的丰度相对较低，而且它们的两亲性使高效提取变得困难。但是，针对这个问题的富集策略已经被开发出来以促进基于MS的蛋白质组学对细胞表面蛋白的全面分析了。方法总结在表2。
表2 基于MS的研究细胞表面的细胞间信号蛋白的蛋白组策略
由于大多数细胞表面连接的蛋白是糖基化的，因此聚糖可以作为亲和或化学选择性富集的目标。例如，凝集素结合多糖使细胞表面蛋白的纯化和检测具有简单和高通量兼容的特点。另外，聚糖被轻度氧化形成醛，可通过色谱连接在固相的上联腙或肟捕获富集。利用这一策略，Cogger等鉴定了从人类多能干细胞分化的胰腺祖细胞新型细胞表面标记蛋白。由于这些方法也能丰富细胞内糖基化蛋白，因此Wollscheid等开发了一种对表面糖蛋白具有特异性的细胞表面捕获技术，从而推进了这一技术的发展。糖基在细胞上被氧化，随后由亲和探针修饰，防止细胞内糖蛋白被捕获，研究者们利用这种细胞表面捕获技术已经建立了41个人源和31个小鼠细胞系的细胞表面图谱，其中包括了1492个人源和1296个小鼠细胞表面蛋白。近距离标记技术（如APEX和BioID）已经非常成功地应用于研究细胞内蛋白相互作用和定位细胞内的蛋白质，现在正成为表征细胞表面蛋白表达的强大工具。在这些方法中，研究者们用酶对蛋白质进行标记，而这些酶又用活性亲和探针在短半径内标记相互作用和邻近的蛋白质，并且通过基因融合或抗体-辣根过氧化物酶结合来标记靶蛋白，以识别具有功能的表面蛋白簇并生成细胞的蛋白质组邻近图。
4. 信号蛋白在细胞表面的相互作用
了解膜结合信号蛋白和细胞表面受体之间的相互作用是阐明细胞间信号通路的先决条件。表面受体只参与短暂的结合，且通常需要在生理膜环境下才能充分发挥生物活性，因此在大多数传统的蛋白-蛋白相互作用研究中，细胞表面的相互作用很少被提及。随着高通量筛选方法的进步，最近开发的基于MS的蛋白质组学方法促进了细胞外蛋白相互作用的系统研究。所选择的方法总结在表3中。
表3 基于MS的研究配体引导的受体捕获蛋白组策略
目前有一个专门的蛋白质组学方法，提供了一个适用的、高效的程序，以靶向鉴定在接近生理条件下表面受体识别的膜结合配体。首先，配体被特殊设计的三官能捕获分子标记，捕获的配体分子共价结合目标活细胞表面的受体。Sobotzki等人最近开发了HATRIC，它是一个改进版的工作流程，使得捕获分子具有更广泛的适用性和更高的敏感性。另外，先前介绍的近距离标记法在检测细胞表面短暂和微弱的相互作用方面显示出巨大的潜力，也可用于鉴定细胞外配体受体的相互作用。尽管MS和RNA测序研究在单细胞水平建立了细胞间通信网络，但基于MS的策略提供了全面的、基于蛋白的细胞间信号研究策略。从全面蛋白质组学中获得的数据，将为不同细胞类型之间的生理或病理生理信号通路提供强有力的证据。
5. 异细胞系统中的细胞间信号传导
由于大多数技术不能区分细胞混合物中的关于细胞类型的特异性信号，因此不同类型细胞间的信号往往被忽视。基于MS的方法通过对来自不同细胞的蛋白质贴上代谢“条形码”，使得通过细胞培养中氨基酸的反式稳定同位素标记(SILAC)分析细胞间的蛋白质信号成为一种可能性。此外，tRNA Synthetases允许不同细胞类型特异性地结合click化学兼容的非规范氨基酸，推动了不同细胞类型特异性蛋白质组富集及其体内分析的发展。
6. 展望
基于MS的蛋白质组学是识别细胞间信号的强大工具，它能够表征细胞和特定环境的分泌程序，识别尚未被探索的细胞外蛋白功能。此外，它以其独特的优势来检测蛋白分泌形式和特殊的细胞外PTMs。虽然单细胞测序方法在核酸水平上解决了细胞内的异质性问题，但预期的质谱技术发展将使未来能够分析单细胞水平上原代细胞类型之间的细胞间信号转导成为一种可能。