Nat commun. | 南开大学龙加福课题组在“基因表达调控与疾病”领域获得重要进展
一、成果短讯：
2018年9月18日，南开大学生命科学学院龙加福教授团队在国际期刊NATURE COMMUNICATIONS 发表了题为“Paf1 and Ctr9 subcomplex formation is essential for Paf1 complex assembly and functional regulation”的研究成果，报道了Paf1-Ctr9亚复合物的形成对于Paf1复合物的组装和功能调节是必需的相关研究成果，这是龙加福教授团队继2013年在Nucleic Acids Research上发表Paf1和Leo1 亚复合物组装和组蛋白结合中的结构基础的论文后，在Paf1复合物组装和功能调节领域的又一力作。
二、内容简介：
真核基因转录延伸是真核细胞调节基因转录的一个高度有序、而又极为复杂的调控过程。在真核生物中高度保守的聚合酶相关因子1复合物（简称Paf1复合物）在调控基因转录延伸和染色质修饰方面起着重要作用。此外，Paf1复合物在细胞周期调控、干细胞多能性维持、DNA修复和信号转导等多个生物学过程中发挥着作用，复合物中相关基因的突变也会导致包括恶性肿瘤在内的多种疾病。
多功能聚合酶相关因子1（Paf1）复合物（Paf1C）由至少5个亚基（Paf1，Leo1，Ctr9，Cdc73和Rtf1）组成，在基因调控中起着至关重要的作用，并影响发育和人类疾病。龙加福课题报告了人和酵母Ctr9 / Paf1亚复合物的两种结构，它们组装成具有非常相似构象的异二聚体，揭示了Ctr9和Paf1中四聚肽重复模块之间的界面。Ctr9 / Paf1亚复合物的结构可以为人PAF1和CTR9中的疾病相关突变提供机制解释。研究表明，Ctr9 / Paf1异二聚体的形成是酵母Paf1C组装所必需的，并且对于酵母生存力是必需的。此外，Paf1和Ctr9之间相互作用的破坏极大地影响体内组蛋白H3甲基化的水平。综上所述，研究结果为Paf1C的组装和功能调控提供了依据。
三、实验结果：
图1人类CTR9 / PAF1异二聚体的结构。a全长CTR9和PAF1的示意图。PAF1中显示了LEO1相互作用区域（蓝色）和组蛋白H3相互作用区域（橙色）。预测的19个TPR基序（灰色）使用TPRpred（https://toolkit.tuebingen.mpg.de/#/tools/tprpred）定义。用于结构测定的CTR9 （1-249） / PAF1 （57-116）复合物的蛋白质片段用双向箭头表示，并分别用青色和红色表示。b 从侧面观察CTR 9(1-249)(青色)/PAF 1(57-116)(红色)复合体的带状图表示。标记了两种蛋白质的N-和C-末端。从顶部（c）或底部（d）观察的CTR9 （1-249） / PAF1 （57-116）复杂结构的圆柱表示。e CTR9 （1-249） / PAF1 （57-116）复合体的表面表示，其方向对应于（b）中所示的另一侧
图2 人类CTR9 / PAF1异二聚体的相互作用界面。a- e将CTR9（1-249）/ PAF1（57-116）接口分为三个区域，分别对应于CTR9 TPR1-5凹通道/ N端环路PAF1（b，e），TPR1-5侧/ PAF1（c，e）的C末端环，以及PAF1（d，e）的TPR4-5 /αD螺旋的凸面。 三个区域中CTR9和PAF1之间的相互作用细节显示在（b）至（d）中。 电荷 - 电荷或氢键和疏水相互作用分别显示为灰色虚线和辐射弧。e基于结构的PAF1结合片段在各种物种中的序列比对。在这种比对中，根据CTR9（1-249）-PAF1（57-116）和Ctr9（1-313）的结构，人PAF1和酵母Paf1的二级结构分别显示在顶部和底部， Paf1（34-103）和保守残基用红色阴影表示。高度保守的残基，在PAF1（57-116）（4S），PAF1（57-116）（D104K）或PAF1（57-116）（5M）和Paf1（4S），Paf1（L83S）中发生突变或Paf1（D95K）构建体，分别用红色和绿色星号表示。疾病相关氨基酸取代I87M或E109K（图3a中所示的类别1）和D85N或D95Y（图3a中所示的类别2）分别用红色和橙色球体表示。 PAF1中三个CTR9结合区域用虚线框表示。物种缩写：H.s，Homo sapiens; M.m，Mus musculus; D.r，Danio rerio; D.m，Drosophila melanogaster; C.e，Caenorhabditis elegans; S.c，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。 f 共IP实验测试CTR 9(1-249)与PAF 1(57-116)野生型(WT)或突变体之间的相互作用.PAF1 （57-116）（4S）突变体含有四个氨基酸取代L80S，V82S，I84S和L86S。PAF1 （57-116）（5M）突变体含有5个氨基酸取代L80S，V82S，I84S，L86S和D104K。将Myc标记至CTR9的N-末端（1-249），并将GFP标记至PAF1 （57-116） WT或突变体的C-末端。如所示，从用各种质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物。下图显示了每种IP的3％Myc融合蛋白
图3 疾病相关突变影响CTR9和PAF1之间的相互作用。a CTR9 （1-129） / PAF1 （57-116）复合物中疾病相关突变。为了澄清，类别1（界面）中的五个错义突变位点，PAF1的类别2（折叠）中的两个位点和CTR9的类别3（其他）中的一个位点（R98W）用球体突出显示，颜色分别为红色、橙色和绿色。b使用co-IP策略评估包含各种疾病相关突变的CTR9(1-249)和PAF1(57-116)之间的相互作用位点。将Myc标记为CTR9 （1-249） WT或突变体的N-末端，并将GFP标记至PAF1 （57-116） WT或突变体的C-末端。如所示，从用各种质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物。下图显示了每种IP的3％Myc融合蛋白
图4. 酵母Ctr9 / Paf1异二聚体的总体结构。a全长Ctr9/Paf1的示意图。使用TPRpred定义了20个预测的TPR基序（灰色）。用于结构测定的Ctr9 （1-313） / Paf1 （34-103）复合物的蛋白质片段用双向箭头表示，分别用橙色和绿色表示。b从侧面看的Ctr9 （1-313）（橙色）/ Paf1 （34-103）（绿色）复合体的圆柱体表示，标记了两种蛋白质的N-和C-末端。从顶部（c）或底部（d）观察的Ctr9 （1-313） / Paf1 （34-103）复杂结构。e - g Ctr9 （1-313） / Paf1 （34-103）界面分为三个区域，对应于Patr1的Ctr9 TPR1-5凹通道/ N端环（e和图 2e），侧面Paf1的TPR1-5 / C-末端环（f和图 2e），以及Paf1的TPR4-5 /αD'螺旋的凸面（g和图 2e）。三个区域中Ctr9和Paf1之间的交互细节显示在e - g中。电荷 - 电荷或氢键和疏水相互作用分别显示为灰色虚线和辐射弧。h Co-IP实验测试Ctr9和Paf1-WT或突变体之间的相互作用。Paf1（4S）突变体含有四个氨基酸取代L62S，M64S，V66S和L68S。如所示，从用各种质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物。Myc和GFP分别标记为Paf1和Ctr9。下图显示了每种IP的3％Myc融合蛋白
图5 Ctr9的较长的N末端尾部对于其与Paf1的结合是必需的。a 基于结构的Ctr9的N-末端片段在各种物种中的序列比对。在该比对中，人CTR9 （1-38）和酵母Ctr9 （1-53）的二级结构分别显示在顶部和底部，并且保守残基以红色显示。在GFP-Ctr9（N16Δ）构建体[用于b ] 中缺失的酵母Ctr9的氨基酸1-16 用蓝色虚线框标记。参与其与Paf1结合的Ctr9的氨基酸Y10，P11，M13，E14和W15由橙色标记。b Co-IP实验测试Ctr9 WT或Ctr9（N16Δ）突变体与Paf1之间的相互作用。如所示，从用各种质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物。下图显示了每种IP的3％Myc融合蛋白
图6 Ctr9 / Paf1亚复合物形成对酵母Paf1C组装至关重要。a，b由Ctr9（a）和Paf1（b）形成Paf1C的Co-IP实验。如所示，用各种质粒组合转染的HEK293T细胞制备提取物，用琼脂糖结合的抗GFP免疫沉淀，随后用抗-Myc或抗-GFP进行免疫印迹，如所示。顶部图显示IP结果。中间图显示GFP和GFP融合蛋白（GFP-Ctr9或GFP-Paf1）的IP。下图显示了每种IP的3％Myc融合蛋白。星号表示Myc-Ctr9的降解。C酵母Paf1C组装模型。Ctr9 / Paf1异二聚体是Paf1C装配的核心组件。粗线表示Ctr9（1-313）-Paf1（34-103）异二聚体的晶体结构中的相互作用或从IP结果和研究获得的Paf1和Leo1之间的相互作用。细线表示从IP结果获得的交互作用。虚线表示需要进一步研究的相互作用。
图7Ctr9 / Paf1亚复合物的形成对功能性酵母Paf1C的完整性至关重要。a - d Ctr9 / Paf1亚复合物介导的Paf1C装配对酵母细胞活力至关重要。使所示基因型的菌株生长至对数晚期/静止期（过夜），并在YPD平板上以连续稀释度铺板。在30℃（a），37℃（b），含有1M NaCl（c）的YPD和含有0.1M羟基脲（HU）（d）的YPD 上孵育40小时后显示平板。e具有特异性H3K4me1 / 2/3抗体的代表性免疫印迹用于检测甲基化强度（上图），或用H3抗体代表相同负载（下图）。如所示，来自各种酵母菌株的H3K4me2（f）和H3K4me3水平（g）的条形图。该图中的所有统计数据代表来自三个独立批次实验的结果
四、原文学习：