科研 | (国人作品) 肠道菌群介导的NLRP3炎性小体的激活
编译：文文，编辑：小菌菌、江舜尧。
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论文ID
原名：New mechanism ofneuroinflammation in Alzheimer's disease: The activation of NLRP3 inflammasome mediated by gut microbiota
译名：阿尔茨海默症中神经炎症的新机制：肠道菌群介导的NLRP3炎性小体的激活
期刊：Progress inneuro-psychopharmacology & biological psychiatry
IF：4.315
时间：2020.2
通讯作者：韩晨阳&顾艳玲
通讯作者单位：嘉兴学院附属第二医院
实验设计
选择来自AD患者(简易精神状况检查筛选，MoCA score <26)的新鲜粪便用于粪便菌群移植（FMT）。在移植后0、7、14、21、28天进行莫里斯水迷宫实验，检测小鼠神经行为表现。取小鼠结肠组织进行免疫荧光染色，检测小鼠肠道组织中NLRP3的表达。取小鼠大脑的海马结构进行IBA-1免疫组织化学染色。取小鼠大脑的海马结构进行尼氏染色，观察神经细胞的形态数量。取小鼠的肠道组织和海马进行Western blot分析，检测相关蛋白表达情况（肠道粘膜：NLRP3，Caspase-1，ASC和Pro-Caspase-1；海马：IL-1β，IL-18和TNF-α）。ELISA法检测外周血中炎性细胞因子IL-1β，IL-18和TNF-α的表达水平。
Tg组：APP/PS1小鼠；
Tg-FMT-AD组：移植来自AD患者肠道菌群的APP/PS1小鼠；
Tg-FMT-AD-HP组：移植来自AD患者肠道菌群后，移植了健康人的粪便细菌的APP/PS1小鼠；
Tg-FMT-AD-Mino组：移植来自AD患者肠道菌群后，口服米诺环素的APP/PS1小鼠；
Con组：C57BL/6小鼠
Con-FMT-AD组：移植了来自AD患者的肠道菌群C57BL/6小鼠
结果
1 AD患者FMT后小鼠肠道NLRP3炎性小体和炎性因子的表达变化
小鼠肠道组织免疫荧光结果表明，NLRP3的表达在Tg-FMT-AD小鼠中显著增加，在Tg组中检测到NLRP3的表达，而在Con组中则几乎检测不到（图1A和B）。与Con和Tg组相比，Tg-FMT-AD组肠道组织中NLRP3（NLRP3炎性体的关键蛋白），ASC，Caspase-1和Pro-Caspase-1的表达明显上调，表明FMT进一步促进NLRP3炎性小体活化。Tg-FMT-AD组小鼠肠道组织和外周血中炎性因子（IL-1β，IL-18和TNF-α）的表达显著高于Con和Tg组（图1C-I）。
2 AD患者FMT对小鼠海马行为和神经炎症反应的影响
AD患者FMT后，小鼠的行为发生了明显变化。与Tg组明显不同，Tg-FMT-AD组小鼠逃避潜伏期延长，平台发现时间延长，平台穿越次数减少（图2A-C）。这间接反映了记忆能力和运动能力的下调。小鼠海马IBA-1免疫组化和尼氏染色结果表明，Tg-FMT-AD组小鼠海马中的小胶质细胞激活，IBA-1阳性细胞数量增加，小鼠神经细胞有损伤趋势（图2D）。Western结果表明，Tg-FMT-AD组小鼠海马中炎症因子的表达显著上调（图2E和F）。
3 改善肠道菌群组成对小鼠肠道NLRP3炎性小体激活和炎性细胞因子表达的影响
AD患者FMT后，通过健康人群FMT和口服米诺环素来改变小鼠的肠道菌群组成，进而研究小鼠肠道NLRP3炎性小体的激活及其行为。与Tg-FAM-AD相比，健康人群FMT或口服米诺环素能够显著下调肠道组织中NLRP3的表达（图3A和B），显著降低肠道中NLRP3炎性小体关键蛋白的表达（图3C-F），显著降低外周血中炎症因子（IL-18，TNF-α和IL-1β）的表达（图3G-I）。
图3 改善肠道菌群组成对小鼠肠道NLRP3炎性小体激活和炎性细胞因子表达的影响
4 改善肠道菌群组成对小鼠海马神经行为和神经炎症的影响
健康人群FMT和口服米诺环素后，小鼠的行为也得到了明显改善。与Tg-FAM-AD相比，健康人群FMT或口服米诺环素后，小鼠的逃避潜伏期明显缩短，平台上的保留时间延长，平台穿越次数增加（图4A-C），小鼠的记忆力和认知力有所提高。此外，与Tg-FAM-AD相比，小鼠海马小胶质细胞激活的水平和数量明显下调，神经细胞损伤得到了改善（图4D），海马区炎性因子（IL-18，TNF-α和IL-1β）的表达显著下调图4E和F）。以上结果表明，健康人群FMT和口服米诺环素均可以很好地改善AD小鼠的认知能力和神经炎症。
5 肠道菌群对正常小鼠海马NLRP3炎症小体激活和神经炎症的影响
为了检查来自AD患者的肠道菌群是否可以激活肠道NLRP3炎性小体，对正常小鼠进行了AD患者的FMT，小鼠的行为无明显变化。但是，AD患者进行FMT后，小鼠肠道中NLRP3炎性小体仍被激活（图5A）。与Con组相比，Con-FMT-AD组小鼠肠道组织中NLRP3炎性小体关键蛋白水平增加（图5C和D），肠道炎性因子水平升高（图5E-H），外周血炎症因子水平升高（图5I-K）。此外，小鼠海马中小胶质细胞活化和炎性因子表达水平也明显升高（图5B）。以上结果表明，来自AD患者的FMT可以激活肠道NLRP3炎症小体，间接引起海马小胶质细胞的激活和炎性因子的释放。
讨论
AD是老年性痴呆的一种常见类型，是一种以大脑皮层萎缩、海马记忆神经元减少并伴有淀粉样蛋白沉积和神经纤维缠结为病理特征的中枢退行性疾病。炎症反应和淀粉样蛋白产生在AD的发生发展中起着重要的决定性作用。淀粉样蛋白的错误折叠会形成不溶的蛋白质聚集体，诱导氧化应激，产生ROS，同时通过TLRs激活小胶质细胞释放炎症因子。大量炎性因子聚集进一步促进小胶质细胞活化并诱导神经细胞的炎性细胞凋亡，最终破坏患者的记忆力和认知能力。肠道菌群可以降解食物，促进食物中成分的吸收，参与胆汁酸代谢以促进免疫系统发育并维护免疫异常。肠道菌群紊乱可导致多种疾病，尤其是中枢神经疾病，通常被称为“微生物群-肠-脑轴”。此外，肠道菌群通过产生神经递质类似物、形成淀粉样蛋白并诱导低水平炎症反应参与AD的发展。
在研究中，AD转基因小鼠的肠绒毛数目、肌厚度和腺体长度均明显低于正常组。此外，脂肪酸甲酯分析表明，AD小鼠的肠道细菌结构与正常小鼠明显不同，表明AD转基因动物的肠道菌群发生了改变。细菌产物LPS可以通过破坏肠上皮细胞进入血液循环来刺激人体免疫反应。LPS可激活小胶质细胞，引起中枢炎症，这是由肠道细菌引起肠道损伤的机制之一。AD患者脑组织Aβ聚集体和肠细胞表面Aβ纤维聚集体触发的宿主炎症反应类似，这是由TLR2介导的。肠道细菌产生的神经毒素（BMAA）在AD的发展中起着重要作用，它主要参与突触蛋白的错误折叠。先前的研究表明，肠道细菌可以通过多种方式（如炎症反应和神经毒素）促进AD进展。但是具体机制仍需进一步研究。
尽管已经公认肠道菌群在AD中起重要作用，但是尚未确定小胶质细胞活化是否仅受肠道菌群代谢物的影响。在这项研究中，AD小鼠肠道组织中的NLRP3炎性小体被显著激活，而在正常小鼠中未检测到。推测肠道菌群可能引起肠道炎症反应，因此进一步检查AD患者的FMT对肠道炎症小体的影响。AD小鼠进行FMT后，NLRP3炎性小体进一步被激活，炎症因子的表达明显上调，小鼠外周血中的相关炎症因子也升高。大量肠道炎性因子进入体循环后，它们可以穿过血脑屏障进一步到达中枢神经系统，从而引起中枢神经系统炎症。还发现AD小鼠在进行FMT后，认知能力和行为能力进一步降低，海马小胶质细胞被进一步激活，炎症因子上调。为了进一步研究改善肠道菌群是否可以减轻这种现象，进行健康人群FMT和口服米诺环素。结果肠道组织中NLRP3炎性小体的激活和炎症因子的表达被显著抑制。小鼠海马中小胶质细胞活化受到抑制，炎症因子的表达下调并改善了行为。这些结果表明改善肠道菌群可以改变小鼠肠道和中枢组织的炎症反应。排除AD病理干扰后，在正常小鼠中进行AD患者的FMT，也激活了肠道NLRP3炎性小体，并伴有海马中央小胶质细胞的激活和炎性因子的释放。因此可以初步确定肠道菌群可以通过激活肠道NLRP3炎性体并释放炎性因子而间接引起海马的炎症反应。本研究进一步阐明了肠道细菌与AD神经炎症之间的相关性，肠道细菌可以激活肠道中NLRP3炎性小体，NLRP3可以大量激活炎性细胞因子并通过血液循环提高中枢炎症反应水平。这种机制在以前的文献中没有报道过。
结论与展望
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