小太阳
编译：小太阳，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
结肠部位的微生物群落可调控众多营养物质复杂的化学转化过程并释放出具有不同生物学效应的代谢产物。但目前对结肠内部纵向代谢动力学的研究还是十分有限的。本研究借助于气相色谱质谱联用技术和液相色谱质谱联用技术，分析了人类肠道微生物生态系统模拟器的升结肠（AC）、横结肠（TC）和降结肠（DC）区域中特定微生物群落的代谢谱。比较分析的结果显示，就短链脂肪酸产量、代谢谱和胆汁酸的转化而言，AC、TC 和 DC 区域的代谢之间存在很大的差异。宏基因组评估结果显示，不同区域的代谢轮廓与微生物群落组成和遗传潜能之间存在强相关性。总之，本研究为深入了解不同区域微生物群落的代谢差异提供了重要参考，并有助于更好的理解肠道菌群结构与功能之间的关系。
原名：Metabolic Analysis of Regionally Distinct Gut Microbial Communities Using an In Vitro Platform
译名：宏基因组和代谢组分析揭示了肠道不同部位的微生物群落的代谢情况
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
IF：3.571
发表时间：2019.11
通讯作者：Jenni Firrman
所有的培养试验均采用人类肠道微生物生态系统模拟器（SHIME）进行。该系统组成主要包括以下几个肠道区域：胃（St）、小肠（Si）、升结肠（AC）、横结肠（TC）和降结肠（DC）。AC、TC和DC区域用于培养肠道菌群。用于接种的菌种购于OpenBiome公司，由随机选取的健康成年人的粪便样本组成，该成年人日常食用典型的西方饮食。接种后，通过每天饲喂3次组合培养基及含有消化酶的胰液以维持该系统的正常运行。营养物质从胃的区域开始流动，然后从 DC 区域流出。将该系统运行两周以保证其稳定性。收集稳定后三个时间点的样品，用于DNA测序和进一步分析。
将来自一位捐赠者的粪便接种于SHIME系统的两个单元中进行培养，分别标记为样本重复 1 和样本重复 2，待其至稳定后用于短链脂肪酸的产量分析和非靶向代谢组学的分析。采用鸟枪法进行测序以确定肠道菌群稳定的群落组成。收集 AC、TC 和 DC 区域的两个重复样本用于非靶向代谢组学分析和短链脂肪酸的定量分析。
将来自三位捐赠者的粪便接种于SHIME系统中以对比个体差异。将来自每一位捐献者的粪便分别接种于单个SHIME系统中，分别标记捐献者 1、捐献者 2 和捐献者 3，进行培养直至稳定，用于观察胆汁酸的转化。采用16S rRNA基因测序确定每个区域中微生物群落的组成。收集不同时间点的样本用于胆汁酸定量。
1 结肠不同区域之间的代谢谱比较
采用非靶向代谢组学技术对体外模拟器的 AC、TC 和 DC区域收集肠道微生物样品进行代谢谱分析。计算代谢物的皮尔逊相关系数以确定组间和组内样本之间的相似度（图 1）。分析结果显示大多数都是呈现正相关，且结肠区域内的正相关性最强。例如，粪便中的代谢物与其他粪便样品之间的相关性最强。来自不同结肠区域的样本之间表现出一种有趣的模式，即AC 区域的样本与其他区域样本之间的相关性强度下降。而TC 和 DC 区域的样本之间存在较强的相关性，这两个区域之间的区别很小。从而就导致了 AC 与 TC或 DC 区域之间的分离。负相关性仅出现在 Si区域和粪便样本之间，且强度很弱。
图 1 代谢轮廓的皮尔逊相关性分析。将每个样品中鉴定出的代谢物进行相互比较以确定相相关性的强度和方向。正相关以蓝色显示，负相关以红色显示。相关性强度由颜色深浅表示。
基于 Ward 最小方差聚类方法绘制聚类热图，以比较不同区域微生物群落产生的各种代谢物的丰度（图 2A）。根据聚类分析的结果可以得出以下结论：
① 小肠部位存在大量的代谢产物，而这些代谢物在 AC 区域并未发现，这表明这些代谢产物可能被AC区域的菌群利用了并产生了一些替代性的副产物。
② 与其他结肠区域、DM 和 Si 区域相比，AC 区域的代谢产物数量最少。
③ TC 和 DC 区域代谢物数量和种类高度相似，但与 AC区域截然不同。从图表上方的系统树图中形成的分支就可以看出，TC 和 DC区域的代谢谱非常相似，而与 AC 区域的代谢谱相似度不高。与其他结肠区域的菌群相比，AC区域的代谢谱与对照组的相似度更高。
④ 在热图的底部可以看到，在结肠三个区域中存在一组核心代谢物。从系统数树图中的分支可以看出，它们之间存在相关性，且根据颜色强度可以判断出它们在AC 与TC或 DC 区域之间的数量增加。
⑤ 从热图的顶部可以看到，有一组代谢产物主要存在于粪便中。根据系统树图中形成的分支可知，这些代谢物与在结肠区域发现的那组核心代谢物差异很大。粪便中发现的这些代谢物可能是由于暴露于空气中产生的，亦或是由于哺乳动物细胞产生并残留下来的。
⑥ AC 和 TC区域之间代谢物多样性和数量的差异表明TC区域的代谢物产量稳健。由于这些代谢物不存在 AC区域，所以可以得出结论这些代谢物并不是积累的代谢物，因为营养物质是从 AC 区域经 TC 区域流向DC 区域的。相反，TC 和 DC区域之间的代谢物轮廓的相似性表明DC 区域积累的营养物质来源于 TC 区域。
为了进一步探明这些菌群代谢物之间的相似性和差异性，对其进行了主成分分析（图 2B）。AC和 TC 或 DC 区域的样品在主成分 1 轴上可以分开，说明AC 和 TC 或 DC 区域之间的差异在代谢组数据的变异性来源中排首位。来源于 TC和 DC区域的样品，尽管彼此分开，但仍分布在主成分模型中相同的区域。该主成分分析的结果与聚类分析得出的结论一致，AC和 TC 或 DC 区域之间存在显著差异，而 TC和 DC区域差异较小。因此可知，尽管TC 与 DC 区域的微生物群落结构、pH 值和营养物质不同，但这两个区域之间的代谢谱非常相似。
图 2 不同区域之间的代谢轮廓比较。将来自每个肠道区域的样品的代谢轮廓进行相互比较以评估相似性和差异性。（A）使用分级聚类模型表示样本的代谢轮廓（B）使用主成分分析模型表示样品的代谢轮廓。
2 基于群落结构预测代谢活动的区域性差异
DNA 测序结果和代谢组学分析结果均说明了不同区域轮廓的发展变化，尽管TC 和 DC 区域存在明显的相似性。为对群落结构与所产生的代谢物进行比较，开展了Mantel检验和Procrustes统计分析。Mantel检验结果显示，群落组成与它们所产生的代谢物之间存在显著相关性(r =0.8231; p = 0.001)。Procrustes统计分析结果显示群落结构与代谢轮廓互相吻合（图 3）。这些结果均表明可以通过群落结构预测代谢谱。
图 3 群落结构与代谢产量之间的Procrustes分析。将每个样品的群落组成与其代谢产物进行比较。
3 对特定区域结肠微生物群落产生的短链脂肪酸进行定量与评价
短链脂肪酸是肠道菌群进行厌氧发酵的最终产物。为了深入了解结肠不同区域代谢终产物的差异，本研究借助于气相色谱质谱联用技术对短链脂肪酸进行了定量分析（图 4）。定量结果显示，乙酸、丙酸和丁酸占比达 95%，总浓度在80~120 mmol/ L范围内，该结果与之前的报道结果一致。在体外培养系统中，DC区域中总短链脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丙酸和 3-甲基丁酸水平最高，这些代谢物在AC 区域和 TC区域的含量之间不存在显著差异。有趣的是，戊酸是唯一一种在系统中（AC经TC到DC区域）依次增加的短链脂肪酸。由这些数据可知，AC 区域内包含了大部分的（70%）短链脂肪酸，TC 和 DC区域的短链脂肪酸含量较少（图 4）。这也支持了之前的观点，即大多数短链脂肪酸都是营养物质在近端结肠被分解产生的。因为这个体外系统旨在于模拟体内发生的反应过程，所以将组合培养基混合物首先添加到AC区域。组合培养基中含有许多膳食多糖，如阿拉伯半乳聚糖、果胶和木聚糖以及抗性淀粉等，这些营养物质会被微生物群落发酵生成短链脂肪酸。在这个体外培养系统中，营养成分从 AC 区域被输送到 TC区域。TC 区域中的大部分短链脂肪酸是由AC 区域转移过来并积累的，很少量或者并没有是自己发酵产生的。然而，也有可能是TC 区域内的菌群自发产生并利用了这些短链脂肪酸。实际上，有很多研究表明肠道微生物群具有将乙酸转化成丁酸和其他终产物的能力。虽然根据我们的数据无法确定是否正在发生这种情况，但我们的结果证实事实并非如此。如果是TC 区域细菌发生乙酸代谢活动，则可以合理的预测TC 区域的丁酸含量会增加，但我们并没有观察到这种现象（图 4）。DC 区域内短链脂肪酸的数量显著增加，说明产生了一些代谢物。但是，多糖和淀粉不太可能进入 DC 区域，因为它们很容易就被上游的菌群分解。这个假说也得到了一项报道的证实，该报道称远端结肠区域中剩余的可发酵的底物较少。短链脂肪酸的增加可能是由于进入培养系统的一些蛋白质水解所致，因为蛋白质的发酵程度在高pH值环境下会升高。蛋白质水解的主要产物是支链短链脂肪酸。在该培养系统中检测到了两种短链脂肪酸，即2-甲基丙酸和3-甲基丙酸，这两种支链短链脂肪酸从TC到DC区域均显著增加（图 4）。与 TC 区域类似，DC 区域的大部分短链脂肪酸也可能是由于上游流入并积累所致。
图 4 每个结肠区域产生的短链脂肪酸定量结果。使用 GC-MS 测定乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸和总SCFA的含量。
4 短链脂肪酸产量与水解酶基因的群落结构和丰度的相关性分析
为了将微生物群落结构与短链脂肪酸的产量联系起来，我们进行了鸟枪法宏基因组测序。我们找到了与三种主要短链脂肪酸中任意一种显著相关的菌群。这三种短链脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸或戊酸，戊酸是唯一一种在三个区域之间含量增加的短链脂肪酸。几乎所有的相关性都是正相关，且这四种短链脂肪酸的产量与假单胞菌之间的相关性最强。这些结果让人十分惊讶，因为假单胞菌属不发酵糖类，所以通常与短链脂肪酸的产生无关。之前的研究发现脆弱拟杆菌、梭菌属和马赛巨型球菌会产生戊酸。在相关性分析中，梭菌呈弱正相关，但脆弱拟杆菌和巨型球菌与戊酸的产量呈负相关。此外，对于其他菌属，如能够代谢脂肪多糖并释放丁酸的罗氏菌属、直肠真杆菌和柔嫩梭等，并未发现存在相关性。因此，可以认为相关性会受到短链脂肪酸在不同区域之间累积的影响，并不能说明有短链脂肪酸产生。使用此类型体外培养模拟器的主要限制是系统中并没有类似于体内的连续吸收过程。体内产生的短链脂肪酸可以被肠道上皮细胞吸收并产生多种生物学效应。在体外培养系统中，随着底物从AC经TC流动至DC区域，短链脂肪酸也随之流动，这与体内真实的生理过程不符。因此，我们认为将菌群的丰度和短链脂肪酸的产量直接关联起来可能不是探究区域群落结构与短链脂肪酸丰度之间关系的最佳方法。所以我们采用了另外一种方法进行代替，即评估微生物群落中是否存在GH 基因。GHs 是指具有碳水化合物活性的酶，可以将多糖、寡糖和糖复合物分解并释放出短链脂肪酸。尽管目前已经鉴定出大量的 GHs，但人们普遍认为拟杆菌和厚壁菌是 GHs 主要来源，而变形菌中则相对较少。将每个样品的测序读长与直向同源物的KEGG蛋白数据库进行比对，并将以EC编号3.2.1开头的直向同源物鉴定为GH基因。将每个区域内的GH基因进行相互比较，以鉴定从AC区域经TC区域到DC区域存在线性变化的基因。共鉴定出 25 种 GH 基因呈线性变化。当然，有 20 种 GH表现为依次降低，在AC区域中发现的数量最多，而在 DC区域发现的数量最少（图5A）。尽管这些基因的存在并不能证明酶会高效的工作，但这些数据可以表明AC 区域内的菌群发酵和产生短链脂肪酸的能力最强。这一结论也支持了之前的假说，即该体外培养系统中大部分的短链脂肪酸是由AC 区域的菌群产生的。这些数据也说明不同区域内微生物群落的功能能力存在差异。共有 5 个 GH 基因在系统流动过程中呈线性增加，AC 区域中的数目最低，而 DC 区域的数量最高（图5B）。借助于碳水化合物活性酶数据库对这5 个 GHs的功能性活性进行鉴定。其中 3 种GHs（淀粉-1，6-葡糖苷酶、葡聚糖 1，6-α-糖苷酶和纤维素 1，4-β-纤维二糖苷酶）的功能分别是水解糖原、葡聚糖和纤维素的D-糖苷键相连的分支。葡糖淀粉酶水解 D-葡糖糖残基，而环葡聚糖水解酶水解线性麦芽糊精。在5个增加的GH基因中有3个GH基因涉及水解相同类型的分支键，这可能意义重大。此外，DC区域中这些基因的增加在一定程度上可能解释TC区域和DC区域之间短链脂肪酸产量增加的原因。
图 5 结肠不同区域群落结构中 GH 基因的检测结果。（A）检测到丰度依次下降的 GH 基因。（B）检测到丰度依次增加的 GH基因。
5 特定区域肠道微生物群落对胆汁酸的转化
肠道菌群的一项重要功能是将初级胆汁酸转化成次级胆汁酸。采用液相色谱质谱联用技术对3 个捐献者每个肠道部位的胆汁酸进行测定（图6A）。捐献者 1 不同肠道部位之间的胆汁酸含量并没有显著差异。捐献者 2 的 AC 与 TC 或 DC区域相比，胆汁酸含量出现显著下降。对于捐献者 3 来说，AC 与 DC 区域相比，总胆汁酸含量显著降低，TC 区域的胆汁酸含量处于中间水平。从胆汁酸生物转化的角度来分析胆汁酸的存在揭示了只在3 个捐献者的 AC 区域出现了胆汁酸转化的抑制。通过测定初级胆汁酸的数量（胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸）也证明了这一观点（图6B）。分析结果显示Si 和 AC区域的结合型初级胆汁酸减少，而说明非结合型胆汁酸水平相应的出现增加，这表明在肠道菌群作用下发生了解离。次级胆汁酸（脱氧胆酸、石胆酸和鼠胆酸亚型）的增加可以证明在 TC和 DC区域发生了初级胆汁酸到次级胆汁酸的生物转化。
图 6 不同区域肠道微生物群落对胆汁酸的转化。（A）每个捐献者Si和AC、TC和DC区域中初级胆汁酸和次级胆汁酸的总量。（B）初级胆汁酸（胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸）的定量结果。
胆汁酸分析的结果表明胆汁酸代谢的能力存在区域差异。胆盐水解酶普遍具有去结合作用，在pH 5-6条件下作用最强。去结合现象可能出现在 AC区域，因为 AC区域的 pH 值保持在 5.6-5.9 范围内。7α-脱羟基酶将胆酸和鹅去氧胆酸转化为去氧胆酸和石胆酸，并由胆汁酸诱导操纵子（BAI）编码。为了找到基因组含量与胆酸转化的对应关系，我们针对具有胆汁酸转化功能梭菌（Clostrium scindens，Clostrium hylemonae和Clostrium hyromonae）对区域的菌群进行了监测。然后将这些具胆汁酸转化功能的梭菌的丰度与鹅去氧胆酸与胆酸或次级胆汁与初级胆汁酸的log10比值进行比较。从比较结果来看，在 AC 区域内，最小的初级胆汁酸到次级胆汁酸的转化率对应最低丰度的胆汁酸转化梭菌（图 7）。TC区域内发生了大量的胆汁酸转化，但是胆汁酸转化梭菌的丰度与AC区域相似。这可以解释为：负责转化胆汁酸的梭菌属物种极效率级高，即使在低丰度下也可以引起转化。此外，菌群的丰度可能低于检测极限。然而，这可以表明 AC 区域内没有发生转化过程可能是由于其他因素导致的，而不是由于胆汁酸转化菌群的存在与否导致的。DC 区域内出现了大量的胆汁酸转化，而胆汁酸转化菌群的数量也相应增加。
图 7 胆汁酸诱导操纵子（BAI）基因与胆汁酸转化的比较。
6 代谢谱分析和基因组评估证明了体外培养系统特定区域肠道微生物群落的发展
本研究借助于非靶向代谢组学、短链脂肪酸分析和胆汁酸定量分析相结合的方法评估了特定区域肠道微生物群落的代谢功能。采用宏基因组学的方法探究了这些结果与群落结构和遗传潜力之间的相关性，以进一步了解肠道菌群内部结构与功能的关系。总之，本研究数据表明体外培养系统AC、TC和 DC 区域的群落之间在代谢方面存在显著的区域性差异。但是，数据也表明 TC和 DC区域在功能上极为相似。通过非靶向代谢组学分析发现，代谢物类型和丰度的差异更加明显的说明了这一结论。在研究短链脂肪酸的产量和胆汁酸的转化时，TC区域和DC区域之间存在一些区别。尽管存在争议，但TC和DC区域之间的相似性要比AC区域更高。TC和DC区域之间的相似性可能是由于短链脂肪酸分析中发现的相同累积效应所致。但是，这需要进一步研究加以证实。
本研究结果需要通过对其他更多的捐献者进行类似的分析进一步加以证实。因为本研究中的非靶向代谢组学分析和短链脂肪酸分析是针对一位捐献者开展的，且胆汁酸定量分析的研究对象也仅为3 位。众所周知，肠道菌群群落的组成因人而异。因此，由这些群落产生的代谢物也可能是不同的。但本研究在一定程度上确实揭示了肠道菌群的代谢动力学及其与群落结构的关系。特定结肠区域产生的代谢物的类型和数量上的差异可能有助于探明某些结肠疾病主要发生在远端结肠的原因。
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