科研 | ISME: 森林氮循环微生物的多样性-不同的氨化菌和特殊的氨氧化菌
编译：初拥，编辑：小菌菌、江舜尧。
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以氨化作用（涉及多种微生物类群）和硝化作用（仅涉及特殊微生物类群）为重点，对森林氮循环中微生物多样性的生态功能进行了测试。本研究是在一个土壤环境和植物生长逐渐改变的森林斜坡上进行的。本文测量了土壤中氨化和硝化的总速率和净速率，预估了氨化菌和硝化菌的丰度，以及土壤中氨化及硝化菌的群落组成。
预测的氨化菌丰度没有随土壤环境梯度的变化而变化，导致总氨化率没有显著变化。另一方面，硝化菌的数量和总硝化速率逐渐发生变化。从而确定了植物可利用的铵态氮和硝态氮净积累的空间分布。
预测的氨化菌群落组成沿坡度逐渐变化，说明不同氨化菌比特定硝化菌更有可能包含适应土壤环境、在不同坡度进行氨化的类群。我们的研究结果表明，氨化菌和硝化菌的丰度直接影响相应的氮转化率，它们的多样性影响了氮转化率对环境变化的稳定性。这项研究强调了微生物多样性在环境变化和植物生长条件下生物地理化学过程中的作用。
论文ID
原名：Consequences of microbial diversity in forest nitrogen cycling: diverse ammonifiers and specialized ammonia oxidizers
译名：森林氮素循环中微生物多样性：不同的氨化菌和特殊的氨氧化菌
期刊：The ISME Journal
IF：9.267
发表时间：2019年09月
通信作者：Kazuo Isobe
通信作者单位：日本东京大学农业与生命科学研究生院
实验设计
本研究是在日本东京大学千叶分校（35°12′N，140°06′E）的大学森林中的福山县实验分水岭的人工针叶林中进行的。该森林位于海拔124-227 MASL的温带气候区和山区。年平均降水量为2230 毫米，气温为14 摄氏度。2013年9月，在一个小规模（1.09 ha）流域的山脊到山谷的陡坡（约30°）上建立了一个10 × 100-m2的研究地块（图S1）。树木种类的生长速度沿坡向下增加。从2014年5月11日到2014年8月4日，在树木活跃生长季节期间，使用时域反射仪对山脊和山谷处的土壤体积含水量进行了监测。
土壤采样两次（2013年9月和2014年8月）。从矿物层（地平线）0-10cm深的表面取样约200g土壤。2013年9月，在11个点（从山脊到山谷每隔10 m）采集了55份土壤样本，从左到右每2 m采样一次，每个点重复5次（图S1）。2014年8月，在山脊和山谷（距离山脊100 m）采集了10份土壤样本，并进行了5次重复试验。土壤用2毫米的筛网过筛。2013年9月采样的土壤用于调查氮的生物地球化学性质、微生物丰度和微生物群落组成的空间变化。2014年8月采样的土壤用于水分控制试验。测定了土壤的含水量、pH值、NH4+含量、NO3-含量、溶解有机氮（DON）和溶解碳（DOC）含量。测定了土壤中氨化和硝化的总速率和净速率。从土壤中提取微生物DNA，并进行纯化。用qPCR法测定细菌16srRNA基因、细菌和古细菌氨单加氧酶基因（amoA）和细菌含铜还原酶基因（nirK）的丰度，分别估算细菌总数、细菌和古细菌硝化菌和细菌反硝化菌的丰度。用515f-806r引物对土壤细菌16srRNA基因进行PCR扩增，在Illumina平台上进行测序并进行序列分析。为了估计氨化反应微生物基因的丰度和组成，使用PICRUSt来预测功能，通过计算从16srRNA基因序列推断出宏基因组功能内容。对细菌和古细菌amoA的克隆文库进行分析。
水操纵实验：通过对土壤含水量空间变化的调查，我们认为土壤含水量对硝化细菌的数量和硝化速率有很大影响，但对细菌群落组成没有影响。因此，我们在有/无试验性加水的情况下监测了它们在土壤中的丰度和NO3-含量。我们使用了三组土壤：山脊土壤（干土，平均23%土壤含水量）、山谷土壤（湿土，43%）和山脊土壤，加水量与山谷土壤相同（湿土，43%）。将20克土壤放入覆盖铝箔的玻璃容器中，以尽量减少水分蒸发，并在黑暗中在20℃下培养0、14、28、42或84天。这些天，水分流失得到了补充。然后，测定土壤硝酸盐含量。分别于0、42、84天测定细菌、古细菌amoA和16srRNA基因丰度。16srRNA基因在0天和84天进行了测序，13000个序列进行了纯化。所有分析，包括基因定量和16srRNA基因的序列分析，均按之前的方法进行。
结果
1、土壤环境性质
土壤含水量从山脊处的21.4%上升到山谷处的40.8%（R = 0.71，p < 0.001，图1）。在大约3个月的观测中，山脊处的土壤持续比山谷处的土壤干燥（图S1）。土壤pH值也从山脊的5.2-5.6增加到山谷的5.9-6.2（R = 0.62，p < 0.001，图1）。土壤含水量比土壤pH值线性增加。
2、N转换
土壤NO3-含量沿坡度向下增加（R = 0.56，p < 0.001，图1），而土壤NH4+含量没有持续增加或减少（R = 0.13，p = 0.34，图1）。土壤有机氮（DON）含量没有表现出一致的空间变化（R =-0.07，p =0.60，图1），但土壤有机碳DOC含量（R =-0.31，p =-0.02，图1）和DOC/DON（R =-0.53，p <-0.001，图1）沿坡度下降。
沿着斜坡的净氨化和硝化速率在日本森林速率的变化范围内（-0.16至0.98和0.0至3.00 mg N kg–1 d–1，N = 38）。沿着斜坡的总氨化和硝化速率也在日本森林速率的变化范围内（0.82-15.83和0.04-3.78 mg N kg–1d–1，N = 38）。净氨化率沿斜坡下降（R =0.43，p <0.001，图1），表现出上斜坡（距顶部0~40 m）的正值和下斜坡（距顶部80~100 m）的负值。相反，净硝化速率沿斜坡向下增加（R = 0.61，p < 0.001，图1），对较低的斜坡（距顶部40–100 m）为正。总氨化率没有显示出一致的空间变化（R = -0.10，p = 0.48，图1），但总硝化率沿坡度增加（R = 0.57，p <0.001，图1）。
3、微生物丰度
16srRNA基因的丰度并没有表现出一致的空间变化（R = 0.48，p = 0.08，图1），但古细菌和细菌amoA的丰度均都随着坡度的下降而增加（R = 0.52，R = 0.48，p <0.001，图1）。在沿着斜坡的所有位置，古细菌的amoA都比细菌的amoA丰富。细菌nirK的丰度也呈下降趋势（R = 0.54，p <0.001，图1）。我们假设大多数细菌都能参与氨化反应，并观察到16srRNA基因的丰度与总氨化率（R = 0.34，p = 0.01）之间存在弱而正的相关性。我们还观察到古细菌amoA的丰度与总硝化速率（R = 0.45，p <0.001）呈正相关，但细菌amoA的丰度与总硝化速率（R = 0.20，p = 0.16）之间不呈正相关。
4、土壤环境性质、微生物丰度与氮素转化的关系
我们用扫描电镜研究了土壤环境性质、微生物丰度和氮转化之间的关系。扫描电镜分析表明，土壤DON含量对总氨化速率的影响最大（效应大小 = 0.50，p <0.01，图2），其次是细菌总数（效应大小 = 0.27，p <0.01，图2）。土壤含水量（效应大小 =0.39，p <0.01，图2）对细菌总数的丰度有影响，但不受基质/能量来源（土壤DOC或DON含量）的影响。总硝化速率仅受硝化菌丰度的影响（影响大小 = 0.83，p <0.01，图2）。硝化菌的丰度受土壤含水量（效应大小 = 0.82，p <0.01，图2）的强烈影响，但不受基质/能量来源（土壤NH4+含量）的影响。
图2.土壤环境特性、微生物丰度与氮转化之间的层次关系。路径图代表用于描述总氨化率（a）和总硝化率（b）之间关系的完整和最终模型。与两个变量之间的箭头相关联的数字是从多元回归得到的部分回归系数。在最终模型中，实线箭头和虚线箭头分别代表显著（p<0.05）和不显著。
5、微生物群落组成
从16srRNA基因序列细化到17800序列，共获得10651个OTU。微生物群落以变形菌门和酸菌门为主，其次是放线菌门、疣状芽胞菌和浮霉菌门（图S2）。17800个序列中OTUs的数目和Shannon多样性指数所代表的α多样性呈下降趋势（图S3）。总体群落组成沿坡度移动（PERMANOVA:R = 0.47，p <0.001，图3），较远位置的群落组成变得更为不同（Bray–Curtis相似性的Mantel检验：R = –0.428，p <0.001，图S4）。在探索与组成相似性最密切相关的土壤环境变量时，土壤pH值是影响土壤组成的最大因子（R = 0.64，p <0.001），其次是土壤NH4+含量（R = 0.55，p = 0.001）和土壤DOC/DON（R = 0.39，p = 0.04）。
图3.非计量多维标度排序显示了森林斜坡上细菌群落（a）和操作分类单元的组成变化，预测这些细菌群落和操作分类单元拥有沿着森林斜坡的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（b）、精氨酸酶（c）和脲酶（d）的基因。数字是距山脊的距离（m）。
基于17800个16srRNA基因序列分析了KEGG通路。我们得到了N-乙酰氨基葡萄糖苷酶K01207、精氨酸酶K01476和尿素酶K01427（α亚基）的丰度，略高于Langille等人在土壤中的研究，也显示出了PICRUSt的功能基因预测的相对准确性。
利用拥有N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、精氨酸酶和尿素酶产生所必需的基因的OTUs绘制系统进化树，说明它们广泛分布于不同的门（图4）。这些OTUs的绝对丰度，并没有显示出沿坡度的空间变化（图S5），但与总氨化率呈正相关（N-乙酰氨基葡萄糖苷酶R = 0.31，p = 0.02；R = 0.31，p = 0.02对于精氨酸酶，R = 0.36，对于脲酶，p < 0.01）。这些OTUs的组成沿着斜率移动。1159和2273个OTUs的相对丰度分别沿斜坡上升和下降（线性回归，p <0.1，表1），表明它们在群落的上下部分分别占优势。据预测，其中相当一部分具有氨化所必需的基因（表1）。
表1.预测的具有氨化和氨氧化基因的OTUs的数量
基于16srRNA基因分类鉴定为氨氧化菌的OTUs也被绘制到系统进化树上（图4）。与氨化细菌不同，这些OTUs位于特定的系统发育分支中。这些OTUs的相对丰度随着坡度的增加而增加（古细菌的R = 0.70，p <0.001；细菌的R = 0.52，p <0.001，图S6）。相对丰度在上坡增加的otu不具有氨氧化基因（表1）。我们无法分析它们群落组成的变化，因为它们没有沿着上坡被检测到（图S6）。因此，我们比较了山脊和山谷土壤中基于amoA序列克隆库的群落组成。NH3-氧化性古细菌群落组成在山脊和山谷之间存在差异（图S7）。在山脊上，属于OTU_1、OTU_2和OTU_6的古菌无性系占优势，而属于OTU_2、OTU_3、OTU_4和OTU_5的古菌无性系在山谷占优势。相反，NH3氧化细菌的群落组成相似（图S7）。细菌amoA克隆属于OTU_1，在山脊和山谷都占优势。在山脊上占优势的古菌和细菌的amoA-OTUs都不如山谷中的OTUs丰富(图S7）。
6、微生物对水处理的反应
在山谷采集的土壤中的NO3-含量随着培养时间的延长而增加，而山脊土壤中的NO3-含量仍然较低（图5）。从第28天开始，在添加水的山脊处采集的土壤中硝酸盐含量增加。到第84天，沟壑土或水培垅土的NO3-含量高于垄作土（p<0.05）。随着土壤NO3-含量的增加，山谷和山脊土壤中的古细菌amoA丰度分别保持在较高和较低的水平，并从第28天开始在水处理的山脊土壤中古细菌amoA丰度增加（土壤NO3-含量与古细菌amoA丰度的相关性R =0.94，p <0.001）。在第84天，河谷和水培垄作土壤中的古细菌数量均高于垄作土壤（p<0.05）。相比之下，山谷土壤中细菌amoA和16srRNA基因的丰度有所下降，与山脊土壤和水培垄作土壤具有可比性。
图5.微生物对水处理的反应。三种土壤组中硝酸盐含量（a）和古细菌含量（b）和细菌含量（c）amoA丰度：在山脊处采集的土壤（干土，平均23%土壤含水量）、在山谷处采集的土壤（湿土，43%）和在山脊处采集的土壤，其含水量与在山谷处采集的土壤相同（湿土，43%）。非计量多维标度排序显示了84天培养期间三种土壤中氨化物（总微生物）群落组成的变化（d）。
讨论
1 土壤环境性质、微生物丰度和氮素转化的层次关系
我们首先分析了土壤环境梯度对总氨化和硝化速率的影响，以及氨化菌（即总细菌或预测的有氨化功能的OTUs）和硝化菌数量的变化。扫描电镜显示了这些性质的层次关系（图2）。
总速率测量表明，NH4+在所有斜坡位置以恒定速率产生，但仅在较低坡度处通过硝化作用被氧化为NO3-（图1）。这可以解释沿着斜坡上部和下部累积的不同氮物种，如净氨化和硝化速率所示；NH4+位于上斜坡（距顶部0–40 m），NO3-位于下斜坡（距顶部80–100 m）（图1）。这些氮转化可能是由大量的氨化细菌和硝化细菌所驱动的。氨化细菌和NH3氧化性古细菌的丰度分别呈现出与总氨化和硝化速率相似的斜率变化（图1和图5），并显示出与相应的过程速率呈正相关。从相关性（古细菌amoA的丰度，而不是细菌amoA的丰度，与硝化速率相关）和下面讨论的水处理实验的结果来看，NH3氧化性古细菌似乎比NH3氧化性细菌更主要的负责硝化作用。
氨化细菌和硝化细菌的丰度均受土壤含水量的影响，但硝化细菌的丰度对土壤含水量的变化更为敏感（图2）。硝化菌丰度的高灵敏度在水处理实验中得到进一步证实（图5）。垄作土壤中NH3氧化性古细菌对水分调控有积极的响应，这与土壤NO3-含量的增加是一致的。Bustamante等人还观察到，土壤NH3氧化古菌（而非NH3氧化细菌）的生长和硝化活性是通过提高水分利用率而增强的。
因此，我们得出结论，总氨化和硝化速率分别受氨化细菌和硝化细菌的丰度影响。由于氨化细菌丰度对土壤水分梯度的敏感性较低，而硝化细菌丰度对土壤水分梯度的敏感性较高，因此土壤水分梯度对土壤总氨化速率和硝化速率的影响不同。
2 维持氮转化稳定性的系统发育微生物多样性
然后我们分析了氨化菌和硝化菌系统发育多样性的差异对氨化和硝化速率稳定性的影响。微生物功能分析说明，即使在面对环境变化时，微生物群落的组成发生变化，多样性群落的功能也较少受到影响。这是因为不同的群落可能拥有生理上很好地适应新环境条件的类群，并且可以补充受影响类群的功能。
我们的结果表明，上、下斜坡的群落具有不同的氨化细菌分类群（表1和图4），而氨化细菌的丰度并没有沿斜坡呈现一致的空间变化。它们的群落组成被认为受土壤pH值的影响很大。这些结果表明，不同的类群可以适应不同的土壤环境条件（特别是土壤pH），并发挥相同的氨化作用。
相反，斜坡上的硝化菌可能不包括生理上适应上斜坡环境的类群。在山脊上占优势的古细菌和细菌的amoA-OTUs都不如山谷中的OTUs丰富（图S7）。不仅如此，NH3氧化的古菌和细菌在山脊的整个群落中也构成了较小的群体，因为在17800个稀有序列中没有检测到它们（图6）。这表明该地区的土壤环境条件严格地抑制了山脊NH3氧化型古细菌和细菌的系统发育多样性。Gubry Rangin等人研究了NH3氧化性古细菌的地理分布，发现低pH土壤中的NH3氧化性古细菌在系统发育上没有中性pH土壤中的多，在整个群落中只占较小的一组。我们还发现在高酸化森林土壤中只有一种amoA-OTU占优势。黄等人研究了古地理，发现干旱土壤中的古细菌在系统学上的多样性较低。这些结果表明，作为土壤中主要的NH3氧化菌，NH3氧化古菌在系统发育中不太可能拥有偏好或适应低pH和/或低含水量土壤的类群。
因此，根据研究结果，我们可以预期氨化细菌的系统发育多样性越大，对新环境的适应性越强，氨化细菌丰度和氨化速率对土壤环境变化的稳定性越高。
3 微生物多样性在森林氮素循环和植物生长中的作用
我们讨论了土壤环境性质、微生物丰度、微生物多样性和氮转化之间的关系对植物氮有效性的影响。如上所述，氨化细菌和硝化细菌的系统发育多样性可能导致植物可利用的N物种的空间分布（即上坡的NH4+和下坡的NO3-）。以前在其他森林中进行的研究也表明，沿着斜坡的NH4+和NO3-的空间分布模式相似。此外，同一树种在上、下坡间表现出不同的生长速率和氮利用模式；利用土壤基质中较NH4+容易扩散的NO3--和丰富的水分，沿着下斜坡树木生长较快，而沿着上斜坡树木更容易分布它们的生物量到地下部分吸收NH4+和稀缺水。我们研究地点斜坡上的树种，即柳杉，也沿着较低的斜坡生长得更快（见材料和方法部分）。这可归因于较低坡度处的NO3--和水的更高可用性。一些研究还报道了森林中氮有效性空间分布与植物生产力的密切关系。
在前人研究和本工作的基础上，我们认为氨化细菌和硝化细菌的多样性和空间分布可以通过向植物提供氮来影响植物的生长。
4 田间微生物多样性功能作用的测定
研究表明，驱动N循环的微生物丰度对环境变化的反应可能受到系统发育多样性的影响，这最终会影响森林中植物的生产力。我们在这项研究中观察到的更大的功能被认为是微生物多样性在生物地球化学循环中的一个重要功能，但这很少在实地进行测试。
首先，我们必须区分微生物和底物供应对相应生态系统过程的贡献。在比较不同功能微生物群的功能时，由前兆反应提供的底物可以掩盖功能冗余的差异，因此需要仔细考虑。例如，反硝化菌的nirK丰度沿斜坡向下增加（图1），这意味着反硝化速率沿斜坡向下增加。然而，我们不能将认为反硝化菌的功能比硝化菌的功能低，因为反硝化菌的丰度可能受到底物供应（硝化菌产生的NO3）的限制。最近的研究发现，对于反硝化作用，底物的有效性可能比反硝化菌的丰度更重要，并且可能影响反硝化菌的微生物多样性-功能关系。
其次，我们必须区分微生物丰度和群落组成（或多样性）的贡献。相反，对微生物功能的研究可能过分集中在群落组成（或多样性）上，而群落组成与生态系统过程速率的直接关系不大。此外，微生物丰度和群落组成可能主要受不同环境因素的调节。在我们的地点，群落组成似乎受到土壤pH值的强烈影响，而丰富度受土壤含水量的影响更为强烈，正如基于相关性和水分调控实验结果所预期的那样，在水分控制实验中，水的输入没有引起组成的变化（图5）。近年来的研究表明，细菌对土壤pH的偏好在其系统发育过程中比土壤含水量的偏好更为保守，表明土壤pH的变化比土壤含水量的变化对群落组成的影响更为剧烈。细菌生物地理学研究也表明，土壤pH值对群落组成的影响比土壤水分更为显著。另一方面，土壤含水量可以通过改变基质在土壤基质中的溶解性和扩散速率来控制基质对微生物的供给，从而影响它们的丰度，正如在Stark和Firestone用土壤中的NH3氧化菌精确检测的那样。
以往研究微生物功能或微生物多样性-功能关系的研究试图通过控制微生物多样性和丰度以及添加底物来克服这些困难。这些研究支持这样的假设，即广泛的功能，如呼吸和生物量生产，似乎比狭隘的功能，如反硝化和特定化合物的降解，更能抵抗群落组成或多样性的变化，但有些例外。然而，这些研究大多局限于实验室培养和被操纵的微生物群落对底物输入的短期反应，这并不总是反映现场条件。我们阐明了该领域中微生物的功能，并通过关注功能不同的微生物和不同范围的系统发育多样性来讨论其在生态系统氮循环中的重要性。我们利用研究地点的独特特征克服了上述困难：氨化细菌的底物（土壤DON含量）和硝化细菌的底物（土壤NH4+含量）似乎没有沿着斜坡变化（图1）；并且在单一树种分布的小区内，凋落物的化学质量也不会发生显著变化。此外，我们还利用土壤环境特性和树木生长逐渐变化的森林陡坡，在操纵实验的支持下，通过简单的相关性来估计微生物丰度或群落组成与土壤环境特性之间的关系。
结论
我们证明，具有特殊功能的微生物的丰富度直接影响相应的生态系统过程速率，它们的多样性影响着环境变化过程的稳定性。通过对森林中氨化细菌和硝化细菌的研究，我们进一步证明了微生物多样性不仅对生态系统的进程速率有贡献，而且对植物的生产力也有贡献。
在考虑生态系统对环境变化的响应时，微生物功能也可能是很重要。环境变化的影响更有可能在由不太多样或特定的微生物类群执行的微生物生态系统过程中显现出来。与此一致，硝化过程被认为是一个对环境变化敏感的过程，因为硝化菌的数量在环境干扰下波动很大。我们还发现，氨氧化古菌对森林氮饱和背后的生态现象非常敏感，尽管氨氧化作用是稳定的，这也相应地导致了高NO3-从森林中浸出。因此，我们认为微生物功能多样性对于改进陆地氮素模型和预测生态系统对环境变化的响应至关重要。
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