科研 | 病原体和耐药突变的快速筛查——抗生素精准使用的前提（Nature子刊）
本文由面瘫的猫编译，董小橙、江舜尧编辑。
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抗生素滥用导致耐药菌大量出现，使可用的抗生素越来越少。避免抗生素的滥用，需要在快速确定病原体的同时，快速确定它携带的耐药突变，以指导抗生素的精准使用。
作者开发出一种高度集成的微型生物芯片。该芯片具有1024个像素单元，每个像素单元能够独立地进行实时荧光PCR检测或者突变分析。一张芯片即可在2小时以内，完成多种病原的筛查和耐药位点分析。作者用呼吸道病毒和结核杆菌分别证明了该芯片对病原多重检测和位点突变多重分析具有较好的适用性。
论文ID
原名：Multiplexed identification, quantification and genotyping of infectious agents using a semiconductor biochip
译名：一种可用于病原体多重检测、定量和基因分型的半导体生物芯片
期刊：Nature biotechnology
IF：35.724
发表时间：2018年
通信作者：Arjang Hassibi
通信作者单位：InSilixa, Inc., Sunnyvale, California, USA
实验设计
作者使用亚微米级的互补金氧半导体（CMOS）工艺，将1024个DNA生物检测器集成到一块微型芯片中。借助反向荧光技术，每个DNA生物检测器都能对反应液中的核酸进行特异且独立的实时检测。另外，芯片中集成了热循环系统和光学检测系统，在实现多重检测的同时，也实现了同源（闭管）检测。在验证实验中，作者证明该芯片既能够一次性准确检出多种呼吸道病毒（RNA和DNA），也能够一次性检出结核杆菌多个基因上的50多个耐药突变。
实验内容
1 核酸检测分析流程
芯片主要由两部分组成：DNA生物检测器阵列（DNA biosensor array）及其上的液体反应室（Fluidic chamber）。核酸和多重反应试剂进入反应室后，在热循环模块的控制下，对感兴趣片段（Regions of interest, ROI）进行PCR扩增。因正向引物（pf）过量、反向引物（pr）不足，PCR扩增以非对称方式进行，产生大量正向单链DNA（ssDNA）复制子（af）。DNA生物检测器上包被有反向荧光捕获探针（Capture probes），可捕获正向ssDNA复制子并释放信号，从而实现对PCR过程的实时监测。在实时杂交阶段，ssDNA复制子与特异捕获探针结合。在熔解曲线阶段，随温度升高，复制子和探针发生解离并释放信号。因同一复制子与野生型（WT probe）和突变型探针（MT probe）的结合具有热力学差异，通过对两者熔解曲线进行分析，能够对基因位点进行突变检测。
图1 核酸检测分析流程
2 反向荧光技术实现实时能量转换
基于微型芯片实现闭管多重核酸检测，需要一种基于固相杂交的实时能量转换方法。传统能量转换方式（光学、电化学或者机电转换）受到诸多限制，譬如，灵敏性不够高、不适用于高密度阵列或者使用温度范围有限。作者采用反向荧光转换技术（inverse fluorescence transduction，IFT）以克服这些限制。传统荧光检测用非荧光探针捕获荧光标记靶标ssDNA，靶标增加则检测到的信号升高（图2a）。在反向荧光技术中，捕获探针为荧光集团标记，靶标ssDNA为淬灭集团标记。探针因捕获到靶标ssDNA而导致荧光集团淬灭，荧光信号减弱（反向）。因反应液中包含的是淬灭集团而不是荧光集团，在应用反向荧光技术时，反应液对荧光信号检测的干扰被极大地降低，从而可用于实现对固相杂交阵列的实时光学测量（图2b，2c）。
作者提出两种反向荧光策略：（1）在正向引物的5’端标记淬灭集团，通过序列互补使荧光集团和淬灭集团近距离接触以实现荧光淬灭（图2b）。（2）用淬灭集团标记dNTP，结合定制的Taq聚合酶（兼容淬灭集团标记的dNTP）实现复制子的合成。复制子的每一个核苷酸上都携带一个淬灭集团，从而实现更高效的淬灭反应（图2c）。尽管两种策略都可实现，但也各有缺点：（1）探针需要特殊设计以保证荧光集团和淬灭集团能够近距离作用；（2）dNTP的淬灭集团标记导致合成酶工作效率下降、PCR效率下降。
图2 DNA探针结构示例，以及反向荧光技术和传统荧光技术检测点突变时的熔解曲线
3 实时DNA探针设计
反向荧光探针包括三个部分：（1）锚定接头（Linker），将探针固定到CMOS芯片上；（2）捕获探针序列（Capture sequence），由15-35 个核苷酸构成，与靶标序列互补配对，以捕获靶标ssDNA；（3）双荧光标记（Label），在胸腺嘧啶六聚体两端分别标记FAM和TAM荧光集团。（图3a）
相较于传统单荧光集团标记，双荧光标记有两个优点：（1）激发波长和发射波长相差达到88nm，即由FAM吸收激发光，由TAM发出荧光；（2）FAM和TAM都可与淬灭集团相互作用，使淬灭距离更大，淬灭光谱更广。（图3a）
图3 CMOS生物芯片的结构和各组件的微结构
4 CMOS芯片结构
CMOS生物芯片能够在实时监测IFT信号的同时控制液体反应室的温度。外源激发光透过液体反应室的透明塑料盖，激发DNA生物探测器上IFT探针发出荧光。激发光和荧光透过CMOS层后，激发光被阻挡，荧光被底层的光电二极管接收并转化为电信号。电信号经光电流检测器（ΣΔ detector，图3g）放大和数字化后输出。荧光检测系统每秒钟可检测1-50次，检测信号范围至少为5个数量级。32×32阵列共有1024个DNA生物检测器（图3e）。每个检测器独立工作，包被特定的捕获探针并独立进行信号检测。
实现PCR热循环和固相熔解曲线分析的温控系统主要由三部分组成：电阻加热器件（在PCB层，图3b）、温度感应器件（CMOS层，图3c）和散热器件（基底层，图3d）。程序化的温度控制系统，能够对温度进准确测定（±0.3°C）。升降温速率可达到±4°C/s。
5 多重呼吸道病原检测和定量
实验所用呼吸道病原为四种RNA病毒（甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒2型）和两种DNA病毒（腺病毒C亚属和E亚属）。反应液为一步法RT-PCR混合液，并加入一份临床样本核酸、阳性质控核酸和八对淬灭集团标记的引物对。实验所用芯片的249个像素单元包被有IFT探针。其中一组探针是用于捕获反向引物，以检测反向引物的消耗进行扩增曲线测定；另一组探针用于捕获PCR产物正向复制子，验证多重PCR成功进行。每一个探针包被5个像素单元，用作重复测定。
在病原定量检测实验中，作者用5个浓度的甲型流感病毒RNA（100到100000 copies/μl）作为检测底物，进行3次重复实验。通过检测溶液中流感反向引物的消耗（图4a）绘制扩增曲线（图4b），进而估算起始模板浓度。与传统实时荧光PCR类似，Ct值与浓度的log值呈负相关（R2= 0.97，Ct= -3.46log10[C] + 40.63）（图4b）。PCR结束后，包被复制子捕获探针的像素单元可对反应液中的复制子进行特异性熔解曲线分析（图4c）。
在病原多重检测实验中，作者对11份匿名病人样本进行检测，每个样本使用一块CMOS芯片。只有当扩增曲线（Ct < 40）和熔解曲线（melt area > 0.1）都达到限值时才判断样本为阳性。并同时用商业化试剂盒和仪器对11份样本进行检测。CMOS芯片检测结果与商业化检测方法一直（图4d, 4e, 4f）。证明该芯片在病原多重检测结果具有较高的准确性。
图4 采用芯片的呼吸道病毒检测和定量实验
6 结核杆菌耐药位点多重检测
为了证明CMOS生物芯片的基因分型准确性和其多重检测能力，作者同时对结核杆菌（M. tuberculosis，MTB）基因组上16个片段内的54个耐药位点进行检测。这16个感兴趣片段（TB1-TB16）分布在6个不同的基因上，而54个耐药位点分别与三种抗生素有关。实验对14株MTB进行检测，其中一株为药敏型WT，另外13株为耐药型MT。所有MTB序列都经二代测序验证，与表型一致。实验检测底物的核酸浓度为大约5000 genomic copies/ 25μl。
本实验中IFT采用淬灭集团标记dCTP的策略，所以PCR产生的复制子携带大量淬灭集团。实验所用芯片在678个像素单元上包被了104种IFT探针，用于固相熔解曲线分析以区分WT和MT。每种探针包被5个像素单元，用作重复。WT和MT熔解曲线差值的总和用以判断基因型。正值为野生型，负值为突变型。
实验结果显示，一方面，对WT上所有未突变位点CMOS生物芯片都正确分型；另一方面，对13株MT携带的突变位点，CMOS芯片也都成功检出。值得注意的是，有些突变位点处在二级结构高度复杂的高GC区。（图5）
为了更好地展示该芯片对SNP检测的适用范围，作者介绍了其中两个SNP的检测引物的设计策略。I572F SNP位于TB16复制子的无规卷曲段。一个中间带有SNP的简短捕获序列即可成功检测该SNP（图6a）。而D94G SNP位于TB1的稳定发卡结构内（Tm> 80°C），探针难以到达。作者根据局部结构设计了更为复杂的捕获序列，以使探针和复制子更易结合（图6b）。两个SNP都被成功检出。
图5 MTB耐药突变检测实验
图6 依据DNA二级结构设计熔解曲线分析探针示例
实验结论
作者首先设计了一种新的实时能量转换技术（IFT）。采用这一技术，作者开发了一块高度集成的CMOS生物芯片用于核酸检测和位点分析。该核酸检测平台具有快速（小于2h）、精确（扩增曲线定量分析）、多重（受阵列大小和冗余度限制）且同源（闭管）的特点。通过检测不同浓度的核酸和6种呼吸道病毒（包括DNA和RNA）的核酸，作者证明该芯片具有良好的核酸定量和多重检测能力。通过对54个耐药位点的准确检测，作者证实该芯片不仅能够检测病原，还能够分析病原携带的耐药突变。
作者认为该核酸检测平台存在4点不足：（1）因为捕获探针是基于已知序列，所以此方法只能检测已知耐药突变。（2）因为PCR反应体系自身的限制，难以分析超过100个感兴趣片段。（3）当位点的WT和MT混合出现时，MT比例小于20%时难以准确检出。（4）此芯片的现场使用需要再进一步集成核酸提取系统。
点 评
小编以为，一块小芯片在2小时内，不仅对病原进行多重检测、定量检测，还可检出病原携带的耐药突变，简直是精准医疗时代的必备佳品。与多重检测和定量检测相比，耐药突变检测才是本芯片的最大亮点。2小时以内出结果，比传统培养法相比（大约24h）提高了一个数量级，即使与二代测序相比（不少于12h）也加快了很多。但一个芯片只能检测一个样本，显然与它应有的逼格不符。期待作者团队未来新作！
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