科研| PNAS：肠道菌群通过肠5-羟色胺网络调控肠神经系统的成熟
本文由RR编译，张萌萌、江舜尧编辑。
原创微文，欢迎转发转载。
肠神经系统（ENS）在肠道生理功能（如：肠蠕动、消化液分泌、肠血液流动等）中发挥着重要作用。众所周知，肠道中含有数万亿的细菌，这些细菌调控宿主产生包括5-羟色胺（5-HT）在内的多种信号分子、及其它的激素及神经递质等。这些物质在机体正常的生命活动中发挥着重要的作用。5-羟色胺又名血清素，广泛存在于哺乳动物组织中，在大脑皮层质计神经突触内含量较高，其在人体的情绪、精力及记忆力等方面都发挥着重要作用。约有90%的5-HT来源于肠道，肠神经系统中5-HT4受体（5-HT4R）的激活与成人的神经形成和神经保护有关。这篇论文通过实验验证了一则假设：肠道菌群刺激肠道释放5-HT并激活5-HT4R诱导成人肠神经系统的成熟。下文我们将带大家看看作者如何验证这个假设。
原名：Gutmicrobiota regulates maturation of the adult enteric nervous system via entericserotonin networks
译名：肠道菌群通过肠5-羟色胺网络调控肠神经系统的成熟
期刊：PNAS
IF：9.66
发表时间：2018年
通信作者：Fredrik Bäckhed
通信作者单位：哥本哈根大学健康科学院
在啮齿动物中，肠神经元在胚胎发育和出生后就开始形成，在这个过程中神经元和神经胶质细胞也开始形成。过去很长一段时间，人们一直认为除炎症和损伤情况下，在出生21天后的小鼠中不会有肠神经元的形成。但近来研究发现，其实肠神经系统一直进行着持续更新，并通过细胞凋亡维持平衡。因此，这也就证明了成人的肠神经系统具有成熟的可能性和可塑性，但其分子机制仍尚不清楚。最近有2个研究报道了肠道菌群能诱导肠黏膜的5-HT分泌。此外，有研究表明微生物菌群是出生后小鼠黏膜肠神经胶质细胞发育所必须的。但是到目前为止，肠道微生物诱导肠神经系统成熟的机制研究仍是缺乏的。
实验材料：雌性正常养殖实验小鼠（CONV-R）；雌性无菌小鼠（GF）
实验处理：
用正常养殖小鼠盲肠内容物灌胃无菌小鼠获得肠道菌群定植的小鼠CONV-D;用广谱抗生素喂食CONV-R小鼠三周，取其第0、7、14、21天的粪便，进行DNA提取、qPCR并确定细菌种类及数量；灌胃小鼠含伊文思蓝染料的甲基纤维素测得肠总长度及被伊文思蓝染料覆盖的长度；GF小鼠在实验前一天、获得的CONV-D小鼠在三天后腹腔注射5-HT4激动剂sc-53116盐酸水合物；取结肠进行包埋及免疫组化实验。
1、 肠道微生物调节肠转运并影响ENS的神经解剖学变化
与之前的研究结果类似，GF小鼠比CONV-R的肠转运显著慢（Fig.1A）；而GF、CONV-R、CONV-D之间的肠肌间神经元和纵向肌肉/肌间神经丛（LMMP）的神经支配的数量并没有显著差异结肠上皮的神经支配在GF中有减少（Fig.1 B-D）；这些表型变化在菌群定植15天后又出现恢复（Fig.1 A, E-F）。抗生素处理导致小鼠盲肠扩大（Fig. S3A）；此外，肠道菌群的减少导致结肠粘膜和纵向肌肉/肌间神经丛的神经支配数量减少，这也与神经胶质网络的减少有关（Fig.S3 B-H）。这也就说明肠道微生物群在神经肠肌层网络的发育过程中并非必要，但却在该网络的维持过程中至关重要。神经巢蛋白（Nestin）和HuC/D的共表达是成人ENS神经元可塑性的重要标志，肠肌层神经丛中的Nestin+细胞在体内产生神经元。GF、CONV-D、CONV-R小鼠的Nestin+神经元的比例如Fig. 2A所示，定植肠道菌群的GF小鼠的Nestin+神经元的整体比例下降（Fig. 2B），这表明GF小鼠ENS有较高的可塑性。
Fig.1. 肠道菌群调控ENS的结构和功能
Fig. S3 抗生素损害结肠的神经支配
Fig.2. 定植肠道微生物的GF小鼠诱导结肠神经元前体细胞成熟，红色（HuC/D）,绿色（Nestin）
2、定植肠道微生物的GF小鼠诱导神经元前体细胞既存Nestin+亚群的增殖
为验证猜想:定植微生物的GF小鼠是否诱导神经元前体细胞的增殖，作者检测了Nestin和循环markerKi67在结肠肠肌神经节的表达情况。结果发现GF小鼠有5%Nestin+细胞保持增殖能力，这种能力在菌群定植3d及15d时仍在保持（Fig.3 A&B）；而CONV-R仅有1% 的Nestin+表达Ki67。这说明，GF小鼠保持着神经发育的潜力并能被微生物菌群诱导ENS的成熟；Nestin+细胞的神经元分化在肠道菌群定植后出现。
Fig.3. 定植菌群的GF小鼠导致神经祖细胞循环
3、肠道菌群和黏膜5-HT之间的相互作用用来神经保护
5-HT被认为在神经发生及提高神经细胞的存活率中发挥重要作用。作者进一步证明定植肠道菌群的GF小鼠仍保持血清5-HT水平，并且合成5-HT的重要限速酶（Tph1）表达量的增加还可能引起5-HT的增加，而抗生素的作用导致了5-HT水平的降低。
为探究5-HT在维持ENS神经解剖学结构中是否是必须的，作者量化测定Tph1敲除的小鼠（Tph1-/-）的神经元密度，保证Tph1在敲除的小鼠中不表达。GF和CONV-R小鼠中未出现明显的神经解剖学变化，而菌群定植3d的CONV-D的小鼠肠基层神经元的数量及Nestin+神经元的比例显著减少，这表明由肠道菌群诱导分泌的黏膜的5-HT在定植早期的ENS的神经保护中发挥重要作用。
Fig.4. 黏膜5-HT在CONV-D小鼠的神经保护中发挥重要作用
4、肠道菌群诱导神经元5-HT产生
有研究表明肠道神经元的5-HT影响多巴胺神经细胞的发育和存活，并在组织更成熟的ENS网络元件中发挥着重要作用。5-HT在LMMP中免疫组化结果显示:5-HT神经网络在GF小鼠中几乎没有，但是在菌群定植的小鼠中逐渐恢复正常（Fig.5 A&B）；使用TPH阻断剂（PCPA）处理CONV-D小鼠导致小鼠的肠肌层的神经元的密度降低，出现与Tph1-/-相似结果（Fig.D&E）；同时导致Nestin+神经元的比例增加（Fig.5 G&H）。但利用利血平处理的CONV-D和CONV-R的神经元数量和Tuj+神经元密度之间没有显著差异。
Fig.5. 肠道菌群调控肠肌丛神经元5-HT的释放及5-HT4R的激活
5、GF小鼠中5-HT4R的激活诱导ENS的成熟
5-HT4R的刺激也能诱导成鼠肠道内的神经发生和神经保护。5-HT4R在ENS及肌间神经元中均有表达，并且其表达依赖肠道菌群的刺激（Fig.5 A&C）。对定植菌群的GF小鼠进行3d的5-HT4R拮抗剂（GR-125487）慢性注射，结果发现拮抗剂的处理不会影响神经元网络的密度但会导致肠肌层的神经元数量减少（Fig.5D-F），Nestin+神经元的比例显著下降（Fig.5 G&H），这说明5-HT4R也能调控神经元增殖。利用5-HT4R激动剂（sc-53116）处理GF小鼠4d后，结果发现，5-HT4R在GF小鼠中与更快的肠转运有关（Fig.6A），同时，肠肌层神经元的数量和结肠黏膜的神经支配也随之增加（Fig.6 B-F）。
因此，通过菌群定植，肠道微生物刺激神经元和肠黏膜分泌5-HT，并且GF小鼠的5-HT4R激活导致肠神经细胞的成熟和分化。
Fig.6. 5-HT4R调控GF小鼠的ENS解剖学结构和功能
本文选用无菌小鼠（GF）、正常饲养小鼠（CONV-R）、定植正常小鼠肠道菌群的小鼠（CONV-D）及Tph1敲除小鼠（Tph1-/-）等作为实验材料，研究了肠道微生物对肠道神经系统及肠道5-HT网络的影响。实验思路清晰，设计全面，内容详实，论述充分，值得借鉴学习。不过也正如作者所言，实验中所用的利血平是囊泡单胺转运体不可逆的阻断剂，囊泡单胺转运体同时也转运多巴胺和去肾上腺素，因此不能排除这些神经递质也参与了表型变化的可能性，因而，关于5-HT的特异性作用仍需进一步实验验证。