科研 | 野生杨树的根际和内生细菌微生物区系结构差异与生态位的不同
一、导读
植物微生物群落结构是代表植物健康和生长的关键决定因素之一。 然而，对于地上部与地下部群落之间及不同植物微环境中存在的细菌微生物结构组成仍存在很多空白。在这项研究中，通过16s rRNA基因测序技术研究细菌菌群结构，我们研究了杨树不同生态位微生物群落的分化及结构稳定性的假设。同时我们确定了胡杨不同生态位相关的核心细菌微生物群。这也为以后进一步研究菌群结构提供理论依据。
二、论文ID
原名：Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees
译名：野生杨树的根际和内生细菌微生物区系结构差异与生态位的不同
期刊：Microbiome
IF：8.496
发表时间：2017年
通信作者：Bram Beckers
通信作者单位：Centrefor Environmental Sciences, Hasselt University
三、实验设计
四、实验结果
第一条证据链
根际土壤样本中找到的序列要多于植物部分。在根际部分我们鉴定出一小部分读长属于古生菌，根际土壤中有很大一部分不能被明确分类在门水平。在植物部分我们能够区分出大部分读长，只有一少部分不能进行区分。我们能够对大部分读取数据进行分类，只有相对较小比例的读取不分类。
表1 A：质量控制前后的质量指标，所有植物部分52个样本计算的平均读长。B：每个植物样本指定读长的平均数。通过单因素方差和比较检验方法统计分析显著不同。95％置信区间的统计差异用小写字母表示。C：比较在PCR扩增期间共扩增的非靶向16S rRNA序列（％）的数目。D：在门水平读长不能明显分类。对于每个植物部分进行单独评估，数据代表根样和根际土壤15个生物重复，以及根和叶内生菌11个生物学独立重复。
对各部分样本进行稀释性曲线的构建，从图中可以看出内生细菌群落（b,c,d）对比根际群落含量较少。与根际样品相比，内生细菌样品的稀释性曲线形状表现出更高程度的变化。评估每个样品的OTU丰度的稀释性曲线均接近饱和。根际土壤的稀释性曲线开始变得平稳，但更深入的测序可能会揭示更多的OTU。如稀疏曲线所描绘的，内生部分OTU丰度的高度可变性可能由分散和非均匀定殖的胡杨根与植物的不同空间部分所导致。
图1 每个植物部分的Good’s coverage平均值和稀释曲线。Good’s coverage来代表15个独立样本的平均数。基于10000次迭代计算，Good’s coverage代表15个独立杨树样本（根际土壤和根样）和11个重复样本（茎样和叶样）。小写字母代表95％置信区间的统计学差异（P <0.05）。通过OTU数量的描绘稀释曲线。竖直的虚线表示从每个样本进行二次采样以计算阿尔法多样性估计的序列的数目。
根据OTU丰度、Simpson多样性指数和Pielou’s均匀度，分析了每个样品中的α多样性，微生物多样性。对于多样性和均匀度计算，我们发现根际土壤样品和内生样品之间存在明显区别，根际土壤样本对比植物其他部分表现出更高的多样性和均匀度。在丰富度图中，我们可以看出叶的丰富度指数与茎相同，根际土样的丰度指数最高。
图2 细菌群落结构的Alpha多样性分析。a.OTU丰度评估。b. Pielou’s均匀度评估。C.逆辛普森多样性指数。对Alpha多样性评估代表根际土壤和根的15个生物学重复样本与茎和叶的11个重复样本。
第二条证据链
为了比较不同植物部位鉴别的群落成分的组成，使用布雷柯蒂斯差异性来确定群落组成的主要因素。利用主成分分析显示样品中细菌群落结构的所有相似性。A图PCA分析显示，根据不同植物部分的系统发生水平发现，细菌群落菌表现为强聚集。B图分层聚类显示植物部分可以根据土壤和根样完全聚类。茎和叶样品与根际土和根样品能够清楚地区分开来，但根际植物部分并没有进行完全聚类。这表明在门水平和OTU水平上，各个植物部分令细菌微生物群存在差异。内生菌群定殖和稳定群落的形成似乎是一个更可变的过程。
图3 在OTU水平植物各部分细菌菌群结构组成。a 各个样本的主成份分析，区分植物部分的OTUs在PCA图上显示为向量。b. 基于Bray-Curtis差异的样本进行分层聚类。基于Bray-Curtis分析存在的相似性叠加到PCA图上。
为了支持上述PCA分析结果，使用斯皮尔曼等级相关方法进行模拟单因素方差分析来检测植物各部分存在的差异。在门水平和OTU水平上所有植物部分细菌微生物群落存在显著差异。此结果与上图一直起到支持PCA图的作用，表明细菌群落在各个植物部分组成存在差异。
表2 利用Primer7斯皮尔曼等级相关方法模拟单因素方差分析分析植物部分对细菌群落结构影响。显著性等级*P ≤ 0.01; **P ≤ 0.001; ***P ≤ 0.0001。R，相似性分析测试数据。
第三条证据链
通过结构图可以看出，除了装甲菌门、衣原体门、梭杆菌门和E型变形菌门以外，所鉴定的细菌门类均显示出植物各部分特有的细菌门类丰度。对比植物其它部分在根际土样中，检测到放线菌门的显著丰度达到27.19%是根际土样中，δ-变形菌、酸杆菌门、芽单胞菌门、硝化菌属和浮霉菌门均含量较少。α-变形杆菌在根际土样中相比其他植物部分显著减少。与根际土壤和叶样品相比，TM7在根和茎样品中显著富集。特别是TM7，我们观察到根和茎内生细菌样品之间的丰度变化很大。最后我们在茎样中，我们观察到异常球菌 - 栖热菌门与其他植物相比含量较多。
图4 OTUs物种分布图。根际土样与内生根样、茎样、叶样细菌门类相对丰度。变形杆菌OTU在亚类水平上已经被5个OTU代替。主要存在的细菌门类以不同的颜色显示，含量少的门类也被分组并显示为灰色。β-变形菌在根际土壤和根样中明显富集，γ-变形菌在根际土样和根样的丰度较茎和叶样品中减少。
第四条证据链
对于OTU数据，我们将核心细菌微生物组定义为每个植物部位中10个最丰富的OTU，最后产生了27个OTU。通过含量丰富的核心细菌对比发现；可以得出结论，茎和叶样本的微生物群落尽管有不同OTU水平的菌种，但其中变形杆菌属占主导地位，主要是α-变形菌和γ-变形菌属。推测植物微生物群落特定细菌的富集和减少不是被动过程，而是取决于植物宿主对微生物的主动选择，或者某些细菌只能在特定的生态位进行定殖。
图5 植物生态位相关性最多OTU数细菌微生物组。分类树状图展现了各个植物部分的主要细菌微生物。
为了支持OTU水平上的方差分析结果，进一步确定哪些OTU对观察到的植物各部分之间的群落分化负责，我们使用物种指标分析法来计算OTU和植物隔室之间的显着关联性。在完整的矩阵上进行指标分析，而不仅仅是关注核心，还可以发现核心OTU分析可能遗漏的影响部分。当我们使用不包括平均相对丰度大于1％的OTUs的群落矩阵时，我们在根际土壤中发现了6个指标OTU，根样中2个，茎样中2个，叶样中2个。
表3 用Dufrene-Legendre方法指示物种分析程序计算结果，并使用Benjamini-Hochberg方法的错误发现率对P值进行多重比较校正。显著水平：*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01.
五、研究结论
结果发现田间种植的杨树根际微生物组的结构差异性远低于内生部分微生物。根际细菌群落的形成似乎是一个更稳定和控制的过程，而根，茎和叶的内生微生物定殖可变高，展示了内生细菌对茎和叶的适应和调整。并且确定了胡杨不同生态位相关的核心细菌微生物群。
六、点评
该研究确定了在胡杨中一个核心的细菌微生物在不同的生态位的变化。这可以为进一步研究胡杨与微生物之间的相互作用提供更加独立、详细的研究基础。未来可以研究特定的宿主基因型效应的分析，洞察细菌群落对宿主植物的具体变化。
本文由微生太殷继忠编译，殷继忠、江舜尧编辑。