科研 | Nature Medicine：生命第一年肠道微生物组的成熟有助于农场对儿童哮喘的保护作用

编译：如风，编辑：小菌菌、江舜尧。

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导读

孩子在农场长大与哮喘的保护作用相关，但是造成这种作用的机制尚不清楚。在预防过敏:农村环境(牧场)出生队列(PASTURE)的研究中，研究人员使用人类肠道微生物组的16S rRNA序列数据模拟了2至12月龄婴儿肠道菌群的成熟过程。通过估计得到的12月龄婴儿的微生物组年龄（EMA）与先前的农场暴露水平（β = 0.27（0.12-0.43），P = 0.001，n = 618）和学龄期哮喘风险降低有关（比值比（OR）= 0.72（0.56-0.93），P = 0.011）。EMA介导了19％的农场保护效应。在巢式病例对照样本（n=138）中，研究人员发现哮喘与粪便中丁酸的测定水平呈负相关（OR = 0.28（0.09–0.91），P = 0.034），细菌类群可预测丁酸的产生（OR = 0.38（0.17–0.84），P = 0.017）和丁酸-辅酶A（CoA）编码基因的相对丰度：乙酸盐-CoA转移酶是丁酸代谢中的主要酶（OR = 0.43（0.19-0.97），P = 0.042）。本研究以生活环境为入口，结合哮喘疾病，证明了肠道微生物群可能受到环境菌群多样性影响产生哮喘的保护作用，对人类肺-肠轴概念提供了有效的理论依据，对以出生队列结合微生物组、代谢组学探究生命早期肠道菌群的研究具有重要的参考意义。

论文ID

原名：Maturation of the gut microbiome during the first year of life contributes to the protective farm effect on childhoodasthma

译名：生命第一年肠道微生物组的成熟有助于农场对儿童哮喘的保护作用

期刊：Nature Medicine

影响因子：36.13

发表时间：2020.11

通讯作者：Markus J Ege

通讯作者单位：德国肺研究中心；德国慕尼黑Ludwig Maximilian大学Dr. von Hauner儿童医院

Web results那不勒斯腓特烈二世大学

实验设计

本研究的目的为探究在农场长大对于哮喘的保护作用，对象来源于农村环境(牧场)出生队列(PASTURE)，纳入了来自奥地利、芬兰、法国、德国和瑞士生活在农村地区的人群。怀孕的成年妇女被邀请在妊娠晚期参与研究，其中一半的妇女生活在家庭经营的牲畜养殖场。她们的孩子在出生时即被纳入研究，在2月龄、12月龄、54月龄和72月龄时进行家访。附加的问卷在2、12、18、24、36、48、60和72月龄时完成。为保证研究的严谨和统一性，文章先对研究相关的健康结局和暴露情况进行了统一定义。对于收集到的粪便样本，首先进行菌群测序工作，使用引物F515 and R806扩增16S rRNA基因的V4区域，同时对真菌序列也进行了扩增。接着，研究人员对使用iPLEX Gold技术和Sequenom公司的基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱系统，在法国埃夫里国家基因型中心对PASTURE队列中可用的939名儿童进行了基因分型。然后，研究人员对PASTURE队列中301名12月龄婴儿的粪便样本中短链脂肪酸(SCFAs)的代谢物水平进行了测定，并根据标准对样本进行了量化，在301名儿童中，共有209名(69%)儿童纳入本次16SrRNA分析。研究内还包含一项巢式病例对照研究，在51名哮喘患儿和106名12月龄的健康婴儿的嵌套1:2病例对照样本中测定了丁酰-辅酶A(CoA):醋酸辅酶A(CoA)转移酶基因的相对丰度，入选病例对照研究的157名婴儿中，有138人(88%)取得了有效结果。本研究的数据主要使用R软件的3.4.3和3.6.1版本进行统计分析，首先使用R包进行了狄利克雷(Dirichlet)多项式混合物(DMM)建模,对两个时间点的样本进行了聚类，并分别进行了敏感性分析。然后，使用R包进行随机森林回归，根据133个健康个体(真菌组35个)的亚样本在2月龄和12月龄时细菌或真菌属的相对丰度来模拟采样年龄，同时，使用类似的方法估计丁酸盐、丙酸盐和醋酸盐的SCFA评分。在随机森林模型中，根据其对SCFA生产的可变重要性对分类单元进行排序。最后进行了微生物多样性和组成分析及网络分析，通过中介模型及R包验证，评估菌群在属水平之间的相关性，分析并验证在农场环境暴露与发生哮喘之间的关系。

结果

1 微生物组的成熟与组成

在2月龄时(图1a)，双歧杆菌属为优势菌群。然而在12月龄时(图1b)，双歧杆菌的相对丰度减少了一半，而毛螺菌科的Blautia属的相对丰度大幅增加。通过使用狄利克雷(Dirichlet)混合物模型对两个时间点的细菌组成数据进行聚类，确定了5个Dirichlet聚类(DCs)，其中2个聚类主要代表2月龄的样本，2个聚类代表12个月的样本，1个聚类由两个时间点共享(图1c,d)。随着厚壁菌门的出现，DC4和DC5表现出更稳定的细菌模型。在12月龄的样本中，DC3组儿童的哮喘患病率高于DC4组和DC5组(图1f)。

 

图1 第2个月和第12个月肠道菌群的组成。a,b,618名儿童2个月(a)和12个月(b)时最常见细菌属相对丰度(平均相对丰度≥0.5%)的对数标度盒图。c,两个时间点DMM建模分析的五个簇内属相对丰度的对数比例尺热图，得到2×618个样本。d, 618人在第2个月至第12个月期间在DCs之间的过渡。e,第2个月(上)和第12个月(下)最普遍的群集中的哮喘患病率(n =618)

在菌群成熟度分析中，对预测模型贡献最大的类群是Blautia和Coprococcus(图2a)，将预测模型应用于整个种群(n = 618)，在2月龄时，各属的组成与EMA没有明显变化(图2b)，而在12月龄时，出现了一个清晰的模式，Ruminococcus、Roseburia和Coprococcus的数量有所增加(图2b,c),且当对第2个月和第12个月的样本分层时，EMA与精确采样时间点的相关性被很大程度地消除了(图2d)。另外，在12个月时，任何哮喘类型的儿童平均EMA值都明显较低(图2e)。同样，作为一个连续变量，EMA值越高，哮喘风险越低(OR = 0.72 (0.56-0.93)， P = 0.011)，非特应性哮喘风险越低(图2f)。

 

图2 EMA是衡量肠道微生物成熟程度的指标。a, 133名健康人EMA预测模型中的变量重要性。b,主要属相对丰度的堆叠条形图与EMA值的增加相对应。c,在618名儿童中，2-12月龄的儿童在第12个月时EMA相对丰度的Spearman相关性。d,粪便取样时的实足年龄与两个时间点EMA的散点图(n = 2×618)。e,粪便采样时实足年龄的散点图与第12个月时的EMA。f，哮喘表型与DCs(左)和EMA值(右)的关系。

2 EMA及哮喘的农场效应

PASTURE研究旨在评估农场对哮喘的影响(OR = 0.53 (0.30-0.92)， P = 0.023, n = 930)。在2月龄时，未观察到农场暴露对微生物组成的影响，而哮喘保护的PCA轴3与母乳喂养呈正相关，与剖宫产率和妊娠期间母亲吸烟负相关(图3a)，与孕周无关。相比之下,EMA则因母乳喂养时间延长而延迟，但主要受到在农场长大的影响(β= 0.27 (0.12-0.43),P = 0.001)，尤其是特定的农场接触，例如参观动物棚或食用直接从农场获得的牛奶或鸡蛋(图3b)。进一步研究发现，第12个月时，农场儿童被更频繁地分配到更高级的聚类DC4和DC5中 (P <0.001;图3c)。12个月时EMA对哮喘的影响在PASTURE队列中另外102名儿童中得到验证，也就是在第2个月时没有测量的个体(图3d)。在不同的研究中心，这种效应是一致的，农场暴露对EMA的影响也是一致的(图3e,f)。另外，结构方程模型显示EMA在农场中对哮喘的保护作用为19% (P = 0.011，图3g)，在无哮喘母亲的孩子中也是如此(25%，P = 0.024)。并且，农场儿童肠道微生物群的特征更加成熟，包括Coprococcus和Roseburia (图3h)，即产生SCFAs的菌属。

图3 EMA和对哮喘的农场效应。a, 2月时环境因素与哮喘保护PCA轴3的双变量相关性(n = 618)。b,环境决定因素与EMA的双变量关联;c, 618个个体在先前定义的DCs之间的过渡，按农场水平分层。d, EMA对618名2个月和12个月粪便样本的儿童和102名12个月粪便样本的儿童哮喘的影响的荟萃分析。e,不同研究中心EMA对哮喘影响的荟萃分析(n = 720名儿童;奥地利,173;瑞士,209;德国,176;芬兰,162)。f，在不同研究中心对在农场长大对EMA影响的荟萃分析(n = 720名儿童，与e的分布相同)。g, EMA介导的农场成长对哮喘的保护作用的中介分析(n = 626)。h,在农场成长与20个最高单属的联系(n= 720)

3 细菌代谢物和EMA

为了评估细菌类群产生SCFAs的能力，我们使用随机森林模型通过研究细菌属的组成，对209名儿童在12月龄时获得的SCFA测量值进行建模。丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐的产量主要分别是由Roseburia、Bacteroides和Turicibacter进行预测 (图4a)。由于SCFA预测分数相互相关，并且与EMA部分相关，因此我们对EMA和SCFA分数进行了四维PCA分析(图4b;n = 720)。丁酸盐评分和EMA均在维度(Dim)上加载 1，与哮喘和非特应性哮喘呈负相关(图4c)。Dim 1和Dim 3(代表EMA、丁酸盐和丙酸盐得分)与在农场成长呈正相关，与未加工农场牛奶的消费量相关性非常好(图4d)。Dim 1介导了15%的哮喘农场效应，Dim 3另外介导了6%(图4e)。在巢式病例对照研究中，当将基因分析的结果与最初测量的丁酸盐水平和估计的丁酸盐评分进行比较时，我们发现在不同测量值的最低四分位中哮喘的比例特别高(图4f)。另外，与不同哮喘表型相关的所有指标(图4g)都是相似的，例如，与哮喘相关，测得OR值为0.28 (0.09-0.91)，P = 0.034，丁酸盐评分为0.38 (0.17-0.84)，P = 0.017，基因分析为0.43 (0.19-0.97)，P = 0.042。

图4 细菌代谢物和EMA。a,对209名儿童测量值建模的SCFAs丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐预测分数的变量重要性。b,EMA的PCA和三个SCFA得分(n = 720)。c, 哮喘表型与四个PCA维度的关系。d, 在农场长大和饮用农场牛奶与四个主成分分析维度的关系。e,四个PCA维度介导的农场成长对哮喘的保护作用的中介分析(n = 626)。f，丁酸盐评分在138名儿童(44名哮喘患儿和94名健康个体)的病例对照子样本中的验证。g, 哮喘表型与最初测量的丁酸盐水平、估计的丁酸盐评分和基因分析的关联，所有的二分法在最低四分位数。

4 单一细菌类群的网络分析

针对成熟过程的结果，即12个月时的微生物组成和属间的相互关系，我们进行了网络分析(图5a)，揭示了五个网络模块与三个集线器紧密相连。在探索与三个中心基因相关的扩增子序列变异(ASVs)与哮喘的关系时，出现了两种具有哮喘保护作用的ASVs，Roseburia (OR = 0.42 (0.18–1.01), P = 0.053)，且1种与Coprococcus属相关(OR = 0.38 (0.16-0.92)， P = 0.032)。

在对真菌的分析中，我们利用数据进一步探索了真菌的定植关系。估算真菌年龄(EFA)的计算方法与EMA比较，主要依赖于Saccharomyces(酵母菌)、Alternaria(链格孢属)和Malassezia (马拉色菌)的变化。

最后，对数据又进行了敏感性分析。

图5 单一分类群的网络和研究概要。a,单一细菌属的网络分析(n = 720)。b,研究概要。

讨论

在PASTURE队列中，农场相关暴露影响了2至12个月时间窗内肠道微生物的成熟。作为成熟程度的衡量标准，EMA在很大程度上介导了众所周知的对哮喘的农场效应。具有产丁酸盐潜力的细菌群落，如Roseburia和Coprococcus (粪球菌)，有助于保护哮喘(图5b)。

出生方式往往与后来的肠道菌群定植有关，例如Bacteroides (拟杆菌)，即分娩方式对未来健康的重要性突出了母体微生物组在新生儿肠道定植中的作用。然而，目前的分析表明，这种母亲的影响逐渐被影响成长中的孩子的各种环境暴露所取代。事实上，哺乳动物肠道微生物群发展中最具影响力的变化可能是从母乳喂养过渡到固体食物的引入。双歧杆菌的早期优势可能是由母乳的双歧特性培养的，但断奶后其丰度减少。在我们的分析中，第2个月的哮喘保护PCA轴主要受出生方式的影响，并与拟杆菌的丰度相关。双歧杆菌无法解释该轴与母乳喂养的正相关及其哮喘保护作用。

除了这一非常早期的现象之外，2至12个月的细菌数量对哮喘有很强的保护作用。细菌组成的各种变化，包括细菌科Lachnospiraceae、Ruminococcaceae和Bifidobacteriaceae (双歧杆菌科)，提示生命第一年肠道微生物群落具有较高的可塑性。显然，建立哮喘保护微生物群的机会窗口大大超过了经过充分研究的生命最初3个月。另外，EMA在任何时间点都比DC3更好地预测哮喘，强调了有利微生物组的发育方面。细菌组成本身可能不是有益的，但可能表明成功的成熟过程。这一概念对哮喘预防策略有着广泛的意义，因为仅仅应用不同的益生菌或它们的组合似乎对哮喘预防不太有希望。与早期微生物组相比，母乳喂养有利于早期微生物组的发育，但母乳喂养时间的延长阻碍了随后的成熟过程。由于延长母乳喂养时间对EMA的影响与固体食物的含量无关，这一发现支持了停止母乳喂养是影响微生物组成和成熟度的关键因素的观点。

PASTURE研究的特定环境揭示了成熟期的其他主要决定因素，这些因素都与农场暴露有关，这是卫生假说的缩影。众所周知，农场的孩子接触到的微生物群和潜在有益的微生物群更加多样化，且环境微生物对哮喘的促进作用可能涉及多种机制。在目前的中介分析中，我们证明19%的农场效应对哮喘是通过肠道微生物组的成熟介导的，这表明环境微生物组被摄入并与肠道微生物组相互作用。

在探索单一分类单元的方法时，我们没有确定任何分类单元本身具有保护作用。这不大可能是由于统计能力不足造成的，因为我们在单个分类单元Eggerthella中检测到了风险效应，其中包括一种与成人哮喘风险效应相关的新兴病原体。同样地，在鼻微生物组中，我们先前鉴定的个体类群，如Moraxella catharralis，仅仅是有害的。因此，单一类群更有可能产生有害的影响。

另外，由于采样时间点的不同，研究之间可能会出现不一致。例如，特应性喘息的风险与3个月时Faecalibacteriumsp.， Lachnospira sp.，Veillonella sp.和Rothia sp.的相对丰度相关，而与12个月时无关。Veillonella的有益分类单元不仅会随着时间的推移而失去其有益作用，甚至可能以一种哮喘风险分类单元的形式出现。虽然Bacteroides(拟杆菌),Prevotella(普氏菌)和 Coprococcus(粪球菌)与儿童6个月至8岁的过敏性疾病有关，但其他类群如Ruminococcus (瘤胃球菌)已被证明在第一年就失去了它们的有益作用。

当前分析的一个局限性可能是采样仅在两个时间点进行，可能遗漏了这个发育窗口内的波动。然而，这个缺点可能会成为一个优势，因为比较核心成熟过程的起始点和结果可能会突出在这个时间窗口内微生物群的本质变化。为了更好地了解细菌成熟是如何影响呼吸健康的，我们关注了肠道细菌的功能特性，并模拟了极有可能产生不同SCFAs的群落。由于所有的SCFA得分都与EMA相关，我们试图通过PCA来理清EMA和三个SCFA得分的不同方面。EMA成分与产生丁酸盐(Dim 1)的可能性相同，对哮喘的保护作用最强，主要是由于其非特应性表型。对于异位性表型，EMA与丙酸盐生产(Dim 3)共享的方面尤为重要。此外，这两个方面都参与了介导对哮喘的保护性农场效应。相反，醋酸盐的产生与哮喘无关，而醋酸盐主要代表Dim 2。最后，Dim 4表示了EMA的一个方面，不与丁酸盐生产共享；因此，细菌成熟可能对非特应性哮喘发挥单独的保护作用，而不仅仅是丁酸盐的产生。由于丁酸盐是结肠上皮细胞的主要能量来源，有助于维持上皮肠道屏障，具有免疫调节和抗炎作用。因此，不同的类群，其组成在个体之间差异很大，可以直接或通过交叉共生促进丁酸盐的产生。

我们在Roseburia和Coprococcus (or A. hallii)中发现了两个有望保护哮喘的候选ASV，它们也与丁酸盐的产生和丁酰-CoA:acetate-CoA-transferase基因直接相关。我们发现，较高的SCFA水平可以减少身体各个部位的炎症，包括气道粘膜炎症。另外，肠道微生物群的有益作用可能不是针对呼吸健康的。与肠道微生物群成熟相关的细菌(Ruminococcus,Faecalibacterium, Roseburia 和 Lachnospiraceae)也在低肠道感染患病率的儿童中被发现。哮喘和特异表型的定义可能因研究而异，一些研究关注的是早期结果;很少有研究随访5岁时的特应性喘息或哮喘诊断，此时诊断可以合理确定。因此，我们评估了由喘息模式或伴随特异反应所定义的各种哮喘表型。当然，丁酸盐只是一个示例，可能是其他代谢物的标记，这些代谢物可能直接参与肠和呼吸粘膜之间的信号传递，如D-色氨酸，且微生物碳水化合物代谢也涉及到肠道微生物对健康的影响。与所谓的肠脑轴类似，迷走神经也可能参与神经免疫串扰，并参与肠道微生物群和气道张力之间的通讯，EMA对肺功能的影响表明了这一点。

综上所述，我们发现富含微生物刺激的环境对肠道微生物群落的成熟有强烈的影响。丁酸盐产量的成熟和预测部分影响了众所周知的预防哮喘的农业效应，因此影响了人类的肺-肠轴。相反，非典型微生物成熟可能是炎症性疾病的发病机制之一。这强调了在婴儿出生后第一年采取预防策略的必要性，因为此时肠道微生物群系具有高度可塑性，且易于改变。

 

评述

在农场长大与哮喘的保护作用相关，但这一现象的发生机制需要从早期生长发育、肠道微生物组及代谢组学等多方面进行探索。本研究基于一项大型出生队列研究Study in Rural Environments (PASTURE)，使用人类肠道微生物组的16S rRNA序列数据模拟了2至12月龄婴儿肠道菌群的成熟过程，得到的12月龄婴儿的微生物组年龄（EMA）与先前的农场暴露水平和学龄期哮喘风险降低有关。发现了环境中微生物多样性的刺激对于肠道微生物组的成熟有着非常重要的影响，且代谢物中丁酸盐的水平与哮喘发生也存在显著关联。这说明，在生命早期采取相应的预防措施以降低婴幼儿在未来出现呼吸道相关疾病的必要性，对于生命早期健康促进和疾病预防有着重要的意义。

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