科研│SCI TOTAL ENVIRON ：Fugacium kawagutii对缺氮和铵胁迫的生理和转录响应：硝酸盐的迁移

编译：微科盟 寒江雪，编辑：微科盟景行、江舜尧。

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导读

共生菌科是造礁石珊瑚必不可少的珊瑚共生体的来源。珊瑚寄主内共生植物的生长依赖于营养物质，但对于共生植物如何响应营养物质浓度的动态变化，包括不同化学形态之间的转换和丰度的变化，目前还知之甚少。在本研究中，在分批培养的条件下研究了Fugacium Kawagutii对缺氮和不同氮形态(硝酸盐和铵)的生理、细胞和转录反应。研究发现，当NO₃^-或NH₄⁺单独存在时，NH₄⁺的消耗速度比NO₃^-快；当两者的摩尔比分别为1：2、1：1和2：1时，NH₄⁺的利用率高于NO₃^-。此外，缺氮还导致生长、能量生产、抗氧化能力和光合产物运输能力的下降，但能量消耗增加。在NH₄⁺中生长的细胞量与NO₃^-相似，但在养分运输和同化方面消耗降低，而在高浓度下，NH₄⁺表现出抑制作用。这些结果对珊瑚共生的氮营养调控具有重要意义。此外，研究人员还确定了10个高表达和稳定表达的基因作为候选参考基因，为将来的基因表达研究作为潜在的参考基因。

论文ID

原名：Physiological and transcriptomic responses to N-deficiency and ammonium: Nitrate shift in Fugacium kawagutii (Symbiodiniaceae)

译名：Fugacium kawagutii对缺氮和铵胁迫的生理和转录响应：硝酸盐的迁移

期刊：Science of the Total Environment

IF：6.551

发表时间：2020年8月

通讯作者：林森杰

通讯作者单位：康涅狄格大学海洋科学系

DOI号：10.1016/j.scitotenv.2020.141906

实验设计

结果

1    氮素对F.kawagutii生长的影响

在8d的实验期间，NO₃^-和NH₄⁺处理组的生长模式几乎相同，最大细胞浓度分别为148,737和158,420个细胞每mL，只是NH₄⁺处理组出现了一天的滞后（图1A）。而缺氮组，细胞浓度在4d到达平稳状态，在实验期间最高浓度为76,323个细胞每mL。NH₄⁺和NO₃^-以2：1、1：1和1：2摩尔比混合培养组的生长曲线相似，从第4d到第8d的指数生长分别达到最大细胞浓度，分别为194，251、204，010和198,385细胞每mL（图1B）。

2   NH₄⁺和NO₃^-吸收差异与光合作用参数

缺氮组培养物中的NO₃^-浓度很快被消耗，并在3d内降至检测限度以下（图1C）。在NO₃^-和NH₄⁺全氮组中最初NO₃^-和NH₄⁺的浓度相似，第5d开始出现差异，细胞对NH₄⁺的吸收速度快于NO₃^-（图1C）。在混合N培养组（二者摩尔比为1:1）中细胞优先吸收NH₄⁺，直到第5d，剩余NH₄⁺降至检测下限以下时，细胞几乎保持不变（图1D）。第5d后细胞开始吸收NO₃^-，NO₃^-在接下来的三天迅速减少。这种吸收模式在其他不同比例组中也同样出现。

NO₃^-组和NH₄⁺组的最大量子效率(Fv/Fm)基本相似，但NH₄⁺组一天的最大量子效率较低（图1E）。缺氮组细胞叶绿素a含量显著低于富氮组，仅利用NH₄⁺的第5d细胞叶绿素a含量显著高于仅利用NO₃^-组的第7d。结果表明，缺氮组细胞内叶绿素a的含量显著高于NO₃^-组和NH₄⁺组（图1F）。NO₃^-组和NH₄⁺组细胞内C、N含量在第5d高于第7d，C/N比值也高于第7d（图1G）。

图1. F.kawagutii的生长曲线(A、B)、培养基中NH₄⁺和NO₃^-浓度(C、D)、Fv/Fm(E)、细胞叶绿素含量(F)、细胞碳、氮含量和C/N比(G)。

 图2. 三种不同氮素营养条件下的转录谱差异。A 三个处理组的主成分分析。B 三个差异分组的DEG热图。C 三个差异分组的韦恩图分析。D 三个差异分组的DEG的直方图。

3   缺氮导致的转录反应

分别在第5d和第7d从NO₃^-组和NH₄⁺组中收集样本进行转录组测序，在第5d收集氮耗竭组的样本（图1）。在第5d，NH₄⁺+NO₃^-组微生物主要利用NH₄⁺，缺氮组处于饥饿状态。第7d，NH₄⁺+ NO₃^-组仅利用NO₃^-，缺氮组仍处于缺氮状态。对三组样本进行转录组测序分析，PCA分析表明组内生物重复较好，而不同处理组之间差异较大，验证了用于差异表达基因(DEGs)分析的RNA-seq数据的实验设置和可靠性（图2A）。在氮处理条件下，共有3230个基因表达发生显著变化。缺氮VS NO₃^-以及缺氮VS NH₄⁺中的DEG数量相似，但是NO₃^- VS NH₄⁺组的DEG数非常少（图2B，C和D）。

图3.筛选出F.kawagutii中缺氮反应的关键基因的表达量热图。

由于NH₄⁺与NO₃^-比较只有33个DEG，因此没有发现明显富集的GO项和KEGG途径。然而，从N耗尽与N充足的比较中得到的DEG在不同的GO项中都有显著的富集（图3），说明氮营养变量对代谢的影响很大。DEGs最显著富集的生物过程是氮循环代谢过程和氮同化固碳过程。在细胞组分方面，DEGs对叶绿体、质体和核糖体亚基的富集程度最高。在分子功能上，谷氨酸合成酶(NADH)活性、磷脂结合活性和铵跨膜转运蛋白活性在DEGs中具有较高的代表性。另一方面，KEGG分析表明，核糖体、N代谢、光合作用和mRNA调控途径显著富集。

共有52个与氮转运和代谢有关的基因在缺氮组和富氮组中有差异表达，这53个氮响应基因中，有20个编码铵转运蛋白(AMT)，其中16个在缺氮条件下表达上调，其余4个在缺氮条件下表达下调。缺氮条件下，13个NRT基因和3个亚硝酸盐转运蛋白基因表达上调。其中只有一个尿素转运蛋白(DUR)基因在缺氮条件下表达下调。此外，还有8个转运蛋白基因表达上调，16个转运蛋白基因表达下调。进一步分析氮的胞内转化过程发现，6个硝酸还原酶基因(NADH)和1个天冬酰胺合成酶(ASNS)基因在缺氮条件下上调，3个谷氨酸合成酶1基因(GOGAT1)、3个铁还蛋白依赖的谷氨酸合成酶基因(GOGAT_FD)、1个3型谷氨酰胺合成酶基因(GSIII)和另一个ASNS基因在缺氮条件下表达下调（图3）。这些结果表明，由于氮的有效性有限，氮营养获取机制促进有效氮的吸收，并降低同化的消耗。

在这52个氮响应基因中，有8个在氮耗竭条件下发生响应，而在其他8个基因在处理条件下不受调控，它们分别编码AMT1、NRT、GOGAT1、亚硝酸盐转运蛋白和GSIII，这可能是F.kawagutii受氮胁迫所特有的响应。

另一个主要关注的方面是光合作用，大多数参与光合作用电子转移链(ETC)的基因在缺氮条件下表达上调。这些基因包括8个编码光系统II蛋白的基因、3个编码光系统I蛋白的基因、4个编码叶绿体ATP合成酶的基因、1个编码铁氧还蛋白的基因、1个编码细胞色素b6-f复合铁硫亚单位的基因和2个编码细胞色素c6的基因（图3）。相反，在缺氮条件下，卡尔文循环中CO₂固定所必需的基因rbcL的表达下调。

第三个显著富集的功能与细胞周期和抗应激相关。对细胞分裂相关基因的分析表明，缺氮组中有10个基因表达下调，这与缺氮条件下较低的生长速率是一致的。在本研究中7个编码30S核糖体蛋白的基因和10个编码50S 核糖体蛋白编码基因在缺氮条件下调，而15个编码40S核糖体蛋白的基因和36个编码60S蛋白的基因上调（图5A），表明为响应缺氮胁迫，细胞器蛋白质合成能力下降，而细胞质蛋白质合成能力增加。活性氧清除相关基因的分析发现，在缺氮条件下，ROS清除机制可能发生了改变，降低了植株的抗氧化能力。

第四个重要的途径与糖酵解和三羧酸循环有关。糖酵解途径中1个编码磷酸甘油酸变位酶的基因下调，而1个磷酸甘油酸变位酶基因，5个甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Gapdh)，1个二磷酸果糖醛缩酶基因和2个丙酮酸激酶基因在缺氮条件下上调。在这些基因中，糖酵解的限速酶之丙酮酸激酶，己糖激酶和磷酸果糖激酶在N条件下转录丰度没有明显变化。TCA循环分析中发现，缺氮条件下，只有柠檬酸合成酶基因有略有下调，而异柠檬酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶无差异表达。

第五个显著富集功能与细胞壁和细胞膜相关。5个编码膜蛋白的基因、19个编码外膜蛋白的基因、5个编码细胞壁蛋白的基因和2个编码胞外基质蛋白的基因都在缺氮条件下下调，这些都是细胞表面结构受缺氮影响的一致证据（图5B）。

图4. 8个氮胁迫特异基因在9种营养条件下的表达变化。

图5.在缺氮条件下，F.kawagutii核糖体蛋白(A)和细胞表面结构蛋白(B)编码基因表达的log₂倍变化。

4   从利用NH₄⁺转换为NO₃^-的转录反应

从转录组数据中得出与NO₃^-相比，在NH₄⁺中氮转运和同化的分子功能显著富集（图6A）。在52个与氮吸收和同化相关的基因中，有24个基因是响应缺氮条件，还有24个基因响应从NH₄⁺到NO₃^-的转化（图6B），但是这些基因的变化倍数较小，在这24个基因中，有6个基因的倍数变化在1.5-2之间，18个基因的倍数变化在1.2-1.5之间。在NH₄⁺条件下，只有DUR基因表达上调，其余23个基因表达下调，说明当NH₄⁺是主要的氮素营养时，氮素的运输和代谢受到抑制。此外，对活性氧清除基因的分析表明在NH₄⁺条件下，抗坏血酸过氧化物酶(1.5~2倍，P<0.05)、谷胱甘肽S-转移酶(1.2~1.5倍，P<0.05)和过氧化物还原蛋白(1.2~1.5倍，P<0.05)的编码基因均有中度上调。

图6. F.kawagutii中DEG主要富集的GO通路及52个氮N响应基因在利用NH₄⁺与NO₃^-的表达。A DEG的GO富集结果。B 52个氮响应基因在NH₄⁺与NO₃^-条件下的表达热图。

5   核心基因集的更新

研究发现在三种氮素处理条件下，共有1176个基因表现出较高表达水平。这些核心基因的平均表达量为66.38TPM，变化范围为35.12TPM~1005.6 TPM。其中1067个基因有GO功能注释。研究人员先前已经确定了115个核心基因，这些基因在9种不同的生长条件下都有较高水平的表达。本研究将先前的核心基因集与目前的核心基因相结合，构建了核心基因集3（图7A）。在这10个基因中，微管蛋白的表达量最高，而E3泛素蛋白连接酶的表达量最低。表达稳定性分析发现酪氨酸脱氧核糖核酸磷酸二酯酶2和捕光复合体I是最稳定的基因（图7B）。

图7. 三种氮素条件下10个核心基因的表达水平和稳定性分析。A基因表达水平的盒子图。B geNorm计算基因表达的稳定性及其排序。

 

讨论

1    缺氮抑制生长、光合作用、抗氧化能力和共生潜力

大多数浮游植物对缺氮的典型反应为细胞生长、细胞叶绿素a和细胞含氮量下降，本研究发现的现象与其一致。在缺氮条件下，细胞分裂基因表达下调，参与叶绿素合成和电子传递功能的大部分DEG表达上调，细胞叶绿素含量降低，表明细胞通过产生能量和还原剂来响应缺氮。本研究转录组数据表明大多数编码40s和60s核糖体蛋白的基因在氮缺乏的情况下表达上调。这与增加氮转运蛋白和同化相关酶的合成以及其他氮胁迫反应蛋白是一致的。

缺氮会导致浮游植物固碳能力下降，然而大多数参与糖酵解的DEG在缺氮条件下表达上调，如丙酮酸激酶、磷酸甘油变位酶、果糖二磷酸醛缩酶、GAPDH等，这可能表明缺氮细胞需要消耗更多的葡萄糖来应对缺氮。这将导致寄主可利用的光合作用产物的产量减少。本研究发现阳离子氨基酸转运蛋白和脯氨酸/甜菜碱转运蛋白基因也下调了，这可能是向宿主输出氨基酸和有机碳的能力减弱的信号。

转录数据表明，编码L-抗坏血酸过氧化物酶7和谷胱甘肽S-转移酶的DEG表达下调，这表明在缺氮情况下抗氧化能力可能会下降。在缺铁的情况下，谷胱甘肽转移酶和抗坏血酸过氧化物酶的表达下调，这表明铁和氮的缺乏都会导致抵抗氧化损伤的能力减弱。氮是合成谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化蛋白的必需元素，缺氮会降低这些抗氧化剂的活性。

在本研究中，与细胞壁蛋白、胞外基质蛋白和细胞膜蛋白相关的基因在缺氮条件下表达下调，揭示了细胞表面结构受N-养分有效性的影响，营养缺乏(N，Fe)可能会对共生造成潜在的负面影响。

2   缺氮响应基因

本研究在缺氮条件下对52个参与氮素运输代谢的基因进行了研究，认为这些基因是F.kawagutii的氮素应答基因。其中，大多数编码NRT和AMT的基因在缺氮条件下表达上调，编码GOGAT_FD、GOGAT1、GSIII和ASNS的基因在缺氮条件下表达下调，与之前研究一致。F.kawagutii在促进有效氮的吸收和减少同化设备的投资方面与其他藻类相似，都是通过促进速效氮的吸收来应对缺氮。

3   NH₄⁺优先于NO₃^-及其分子机制

单独培养时，F.kawagutii吸收NH₄⁺的速度比NO₃^-快。有两种可能的解释。首先，F.kawagutii中AMT基因的数量(84个)高于NRT基因(62个)，其次，NH₄⁺也可以通过包括钾通道/转运体在内的非特异性系统在质膜上移动。NH₄⁺的吸收速度比NO₃^-快，导致铵态氮培养的细胞单位C：N比低于硝酸盐培养的细胞。当培养基中同时提供NH₄⁺和NO₃^-时，F.kawagutii不仅优先利用NH₄⁺，而且显著抑制NO₃^-的吸收。

尽管F.kawagutii优先吸收NH₄⁺，并在细胞中储存更多的N(可能作为氨基酸或蛋白质)，但高浓度的NH₄⁺对生长表现出抑制作用。这种毒性效应背后的机制尚不清楚，但在植物中，类似的毒性效应被归因于抑制对阳离子(K⁺，Mg²⁺，或C a²⁺)的吸收和根系呼吸。

52个N胁迫响应基因中有23个响应了从NH₄⁺到NO₃^-利用的转换，与NH₄⁺的利用相比，使用NO₃^-需要额外的步骤，首先将其还原为亚硝酸盐，然后再还原为NH₄⁺，然后才能将其同化为氨基酸。说明利用NH₄⁺作为氮素养分可以节约能源，同时也降低了氮素运输和代谢基因的表达水平。这些释放的能量可能被重新分配给其他代谢需要（图8），这对维持健康的共生是至关重要的。因此，抗坏血酸过氧化物酶、谷胱甘肽S转移酶和过氧化物还蛋白基因在NH₄⁺条件下比NO₃^-条件下略有上调(P<0.0 5)，细胞碳含量也较高。

图8. 缺氮和NH₄⁺条件下F.kawagutii代谢途径的示意图。

4   高表达基因与核心基因集更新

本研究发现铁氧还蛋白、PCP、NRT、细胞色素c-550、磷酸甘油酸激酶、rbcL、mRNA预处理因子6和主要碱性核蛋白2在三种氮素处理条件下都高度表达。其中，PCP、NRT和rbcl在5种微量金属培养条件下也有较高的表达。表明F.kawagutii具有较强的捕光和营养运输能力。

通过将现有数据与先前在F.kawagutii中报道的数据相结合，发现有10个基因在11种不同的条件下表现出稳定和高表达水平，包括P营养物质、微量金属和N营养物质，将其命名为核心基因集版本3。在这个核心基因集中，有两个基因被注释为微管蛋白α链，其中一个基因的表达水平在所有基因中最高。在11种处理条件下，微管蛋白的稳定和高表达水平使得微管蛋白最适合作为F.kawagutii基因表达研究的候选参考基因。GAPDH是另一个最常用的参考基因，但在本研究中，这些基因中有四个都在缺氮情况下上调，这使得它不是F.kawagutii缺氮基因表达研究的良好参考基因。

结论

本研究记录了F.kawagutii响应缺氮的反应特征，以及在NH₄⁺和NO₃^- 之间的转换，并进行了生理、细胞特征及转录组分析。结果表明，缺氮导致细胞生长、叶绿素a含量、能量生产、活性氧清除能力和光合产物运输能力下降。此外研究结果还说明F.kawagutii优先利用NH₄⁺，而且比NO₃^-更快利用。在NH₄⁺上生长的细胞量与NO₃^-相似，养分运输和同化的能量却降低，表明细胞内的能量重新分配到其他代谢过程中。研究还发现高浓度NH₄⁺能抑制对NO₃^-的吸收和生长，但是具体的分子机制还有待进一布研究。此外，本研究还提出10个高表达和稳定表达的基因，它们可以作为基因表达研究所需的候选参考基因。