综述 | 鲁汶大学附属医院：过敏和哮喘的上皮屏障
编译：怀瑾，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Epithelial barriers in allergy and asthma
译名：过敏和哮喘的上皮屏障
期刊：Clinical reviews in allergy and immunology
IF：7.328
发表时间：2020.6
通讯作者：Peter W. Hellings MD
通讯作者单位：University Hospitals Leuven, Belgium
DOI号：https://doi.org/10.1016/j.jaci.2020.04.010
主要内容
1.气道上皮细胞多样性
气道上皮是一种动态组织，需经历连续且缓慢的更新过程以维持假复层结构。基于其结构、功能和生化特性，人气道上皮由纤毛上皮细胞，分泌粘液的杯形细胞，club细胞和基底细胞组成。最近，单细胞RNA测序技术发现表征人和小鼠气道上皮中的3种其他特化罕见的细胞类型，即神经内分泌细胞，孤独化学感觉细胞和离子细胞。在慢性气道疾病中，气道上皮不断更新会导致上皮细胞类型失衡、活化状态改变或通透性增加，从而损害正常的气道上皮功能。
纤毛上皮细胞是气道内的主要细胞类型。纤毛上皮细胞含有大量纤毛，对发挥其清除功能至关重要。纤毛摆动频率的降低、纤毛缩短或损耗是哮喘和过敏性鼻炎（AR）患者气道上皮的特征。分泌粘液的杯状细胞是分泌性细胞，将粘蛋白分泌到气道内表面，从而捕获环境分子。Muc5AC和Muc5B被认为是气道中的主要粘蛋白。由IL-4和IL-13驱动的杯状细胞过度分化会打破Muc5AC和Muc5B的平衡，这种现象与哮喘、AR及慢性鼻窦炎（CRS）有关。最近定义了三种杯状细胞转录亚型，即未成熟的杯状细胞，杯状-1细胞和杯状-2细胞。气道基底细胞是在上、下气道中发现的干细胞样祖细胞，依赖于Notch信号的调节分化为纤毛上皮细胞、杯状细胞或其他特化的上皮细胞。club细胞是小气道的穹顶状立方体非纤毛细胞，分泌一种属于分泌球蛋白家族（SCGB1A1）的特定蛋白。为响应上皮损伤，在E-钙粘蛋白介导下club细胞能够分化为纤毛和分泌粘液的杯状细胞。最近有研究利用单细胞RNA测序鉴定出鼠气道中新的club细胞亚群。
神经内分泌细胞以单独的细胞或神经内分泌体的细胞簇形式出现，位于变应原和其他有害物质聚积的气道分支点。这些细胞含有致密颗粒，包含多种神经肽、胺和神经递质，并受交感和副交感神经系统神经支配。神经内分泌细胞充当气道化学感受器，监测气道状态，并通过与神经系统的突触向其他肺细胞或大脑发送信号。孤独化学感觉细胞，因存在顶端微绒毛簇而常被称为簇绒细胞。其功能和信号传导途径与肠道簇绒细胞非常相似，即调节2型免疫。孤立的化学感应细胞表达瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员5，G蛋白偶联受体的甜味苦味受体家族和琥珀酸受体-1。通过其下游细胞内效应分子（如α-gustducin和磷脂酶Cβ2）进行信号传导。此外，这些细胞可作为上皮IL-25的独特储存库。IL-25是一种早期上皮衍生的细胞因子，参与在变应性哮喘和慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者（CRSwNP）中常见的2型炎症反应。离子细胞是最新被鉴定为小鼠和人气道上皮中的一种新型细胞，起源于基底细胞。离子细胞高度表达囊性纤维化跨膜电导调节剂（CFTR），是其主要来源。因CFTR包含的C -末端相互作用域调节紧密连接的组装和上皮分化，推测这些细胞在调节上皮屏障功能中起关键作用。
大多数环境分子被捕获在粘液层中，并通过睫状运动从气道清除，以使其与气道上皮的接触最小化。气道粘液的产生是一个严格调节的过程，对维持有效的上皮屏障功能至关重要。如前所述，Muc5AC和Muc5B之间的平衡对于健康的粘液至关重要。
物理屏障取决于相邻上皮细胞-细胞粘附复合物之间的协同相互作用（图1）。紧密连接（TJ）位于细胞内连接的最上方，并且是细胞旁通透性的关键调节剂。依赖于特定分子的分布，TJ可维持上皮的大小及离子选择性通透特征，并限制大分子的转运。ZO-1，ZO-2和ZO-3分子是TJ相关的主要胞质蛋白。粘附连接位于TJ的正下方，提供细胞间粘附以维持上皮的完整性。粘附连接由钙粘蛋白-连环蛋白复合物组成，并执行多种功能，如TJ的起始和稳定、肌动蛋白细胞骨架的调控、细胞内信号传导和转录调控。桥粒位于上皮细胞的中点周围，并为气道提供机械稳定性。半脂质体有助于将上皮层附着于基底膜。这些连接结构不仅建立了物理屏障，而且调节上皮通透性，细胞增殖和分化。
为响应损伤，气道上皮迅速修复，从而保护人体免受环境分子的侵害。在此过程中，气道基底细胞向受损区域迁移并完全重建假复层的气道上皮。在慢性气道疾病中已观察到异常的基底细胞增殖和分化。临床研究表明，CRSwNP患者鼻息肉的离体培养基底细胞或哮喘患者支气管活检的基底细胞增殖能力降低。进一步研究认为2型细胞因子在其中起重要作用，基底细胞及其后代具有固有的IL-4 / IL-13基因特征，且在体外可以维持数代。阻断IL-4受体α亚基可降低基底细胞中IL-4 / IL-13信号传导，表明基底细胞的记忆可以通过治疗修复。
多项研究均表明在哮喘，CRSwNP和AR中存在气道上皮屏障的结构和功能紊乱。变应性哮喘中上皮屏障的破坏与TJ缺陷以及粘附连接和桥粒的减少有关，且重度哮喘上皮通透性增加。AR患者与健康对照组相比，occludin和ZO-1的表达降低，这与疾病的严重程度有关。在CRSwNP的活检标本中发现上皮通透性增加，TJ分子occludin和ZO-1的表达不规则且降低，被认为是病理学的关键特征（图2）。数十年来，TH1和TH2内型气道疾病被充分表征化。随着对神经系统和上皮在炎症中作用机理的理解，神经源性和上皮性疾病内型引起越来越多的关注。在上皮功能障碍的情况下，CRSwNP与CRS患者相比，其上皮通透性更高。与AR相比，在无过敏性特发性鼻炎且具有鼻高反应性的患者中，没有发现TH2诱发的炎症或上皮屏障缺陷，间接表明炎症可能是诱导上皮功能障碍的关键因素。尽管在理解TJ的功能方面取得了科学突破，但病理相关的气道上皮通透性研究面临种种挑战。同时，缺乏诊断人气道上皮屏障功能障碍的有效工具，以及对特化的上皮细胞功能的了解有限，这也阻碍了气道上皮屏障相关的临床应用。
图2.鼻炎（AR）和慢性鼻窦炎(CRS)的内型。
实质是上皮屏障内型，为便于理解又以4个主要独立实体来呈现。所有AR和CRS患者均表现出具有1种或多种炎症性内型的临床表型，即所谓的内混型。 CRSsNP：没有鼻息肉的CRS； IR：特发性鼻炎； NHR：鼻亢进； NK：神经激肽； SP：物质P；TRP：瞬时受体电位； URTI：上呼吸道感染。
4.促进上皮渗透性增加的机制
促进上皮通透性增加的机制尚不完全清楚。目前研究者倾向于认为气道上皮缺陷是由遗传特征和不同的内在和外在因素共同作用的结果。
全基因组关联研究已经确定了几种与上皮屏障功能、分化和稳态相关的易感基因，包括原钙粘蛋白-1（PCDH1），钙粘蛋白相关家族成员3（CDHR3），丝氨酸肽酶抑制剂，Kazal 5型（SPINK5）和类骨胶3（ORMDL3）。这些基因对上皮屏障缺陷和气道炎症的确切作用尚不完全清楚。 PCDH1是支气管高反应性的易感基因，是保留上皮连接结构的关键组成部分。siRNA介导敲低的16HBE支气管上皮细胞PCDH1，无论是在建立屏障功能还是损伤后上皮修复期间，均降低TJ和粘附连接，导致上皮通透性增加。与对照组相比，PCDH1在CRS或哮喘患者的鼻腔和支气管上皮细胞的炎症区域的表达较低。CDHR3与蛋白质高表达以及更气道上皮细胞的快速分化相关。肺上皮细胞的单细胞RNA测序显示CDHR3在纤毛细胞中高表达；但与成熟细胞相比，CDHR3在未成熟分化的上皮细胞中的表达更高。研究者利用CRISPR-Cas9发现，原代上皮细胞中CDHR3的敲低不会影响纤毛细胞的发育或分化，但降低上皮完整性。尚不清楚TJ功能降低还是上皮细胞生长的影响导致上皮完整性降低。ORMDL3与哮喘的早期发作有关，并且在鞘脂稳态中起重要作用。多项研究表明，ORMDL3有助于气道重塑和炎症。在体外试验中，高水平的ORMDL3降低了原发性支气管和16HBE支气管上皮细胞claudin 17和E-cadherin蛋白水平。在哮喘小鼠模型中，抑制ORMLD3可重建上皮屏障完整性。
环境和炎症触发因素可能通过表观遗传机制影响疾病相关基因表达，从而诱发具有过敏性记忆的免疫和非免疫细胞。表观遗传调控代表基因调控的次级水平，其可能通过3种主要机制导致基因表达的组织特异性稳定性变化，包括DNA修饰，组蛋白修饰和非编码RNA。哮喘患者上皮细胞中DNA甲基化标记的变化被报道，尤其基础细胞标记物KRT5甲基化程度降低。因此，基底细胞分化失调导致上皮屏障缺陷。小鼠中HDM过敏原可导致与过敏性哮喘发展相关基因的异常甲基化。最近，有研究鉴定了特应性哮喘相关的上皮细胞中特定的甲基化谱。2型细胞因子（如IL-13）能够改变哮喘相关基因附近的DNA甲基化，并增加哮喘和AR患者上皮细胞中组蛋白脱乙酰酶活性。组蛋白尾的可逆乙酰化或脱乙酰化代表了第二种表观遗传调控机制。通过组蛋白乙酰转移酶乙酰化组蛋白尾巴可增加基因转录，而通过组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）去除乙酰基则导致基因抑制。目前发现有18种HDAC亚型，分为4组，分布在不同的组织和亚细胞。Wawrzyniak等报道了哮喘患者支气管上皮细胞中HDAC1和HDAC9的表达增加，而Ito等报告COPD患者的上皮细胞中HDAC2的表达降低。上述结果表明，不同疾病表型中不同HDAC发挥不同的作用。已证明IL-4和IL-13会干扰HDAC活性，表明炎症可能会诱导上皮细胞的长期变化。长期暴露的IL-4和IL-13可通过表观遗传修饰影响最终分化的上皮细胞和基底细胞进而形成过敏性记忆，研究者推测气道上皮细胞被限于某种疾病表型中，导致疾病的慢性化。然而，这种理论需进一步证实。
过敏性气道疾病不仅是免疫系统疾病，而且是由于基因，环境和生活方式等因素之间的相互作用。迄今为止，仅专注疾病免疫成分的疗法并未成功治愈过敏性疾病。一种有吸引力的假说认为气道上皮缺陷是过敏性致敏的促进因素。暴露于有害刺激物（包括内部、环境和/或过敏原成分）都可能阻碍上皮屏障功能，导致有害刺激物与粘膜下固有免疫细胞和血管的接触增加，从而引起过敏和2型细胞因子介导的炎症。
已有数据显示，鼻上皮屏障功能障碍增加了颗粒进入粘膜下腔以及系统循环的可能性。在那些仅鼻黏膜上皮屏障缺陷的实验环境中，吸入变应原即会导致肥大细胞脱颗粒。肥大细胞产生的介质会迅速增加上皮通透性，从而促进过敏原向宿主的渗透。此外，典型的TH2细胞因子IL-4和IL-13在过敏个体的变应原激发后也会释放，导致上皮屏障功能障碍。相反，增强上皮屏障可降低由TH2介导的体内外呼吸道炎症模型中的炎症反应。即使鼻粘膜持续暴露于变应原中，TJs表达增加也与肥大细胞脱颗粒和炎症降低有关。此外，在被动变态反应小鼠模型中，当上皮屏障受损时，我们观察到肥大细胞激活增加。因此，我们推测鼻上皮屏障功能障碍是炎症从上呼吸道发展到下呼吸道的关键因素之一。目前，鼻炎和CRS均是哮喘发生的危险因素，屏障功能障碍假说在一定程度上解释炎症可缓慢发展至下呼吸道。全身性炎症作为AR，CRS和哮喘疾病谱的一部分，可能是促进上、下呼吸道炎症反应的因素之一。
目前，由于缺乏合适的“气道渗漏”临床测试，气道上皮屏障缺损在临床实践中并未常规研究或量化。可以利用不同的技术评估气道上皮通透性。尽管需要侵入性介入，上/下气道的粘膜活检或气道上皮细胞可用于通透性和连接蛋白的组织学分析。此外，甘露醇可用来测量肺上皮通透性的变化，目前已在犬中应用。最近，Georas等使用吸入甘露醇评估哮喘的屏障功能，但哮喘和对照患者之间未观察到甘露醇水平的差异，这可能对吸入甘露醇作为气道上皮通透性标志物的实用性产生质疑。另一种用于研究气道通透性的替代分子是放射性同位素，最早1975年就有报道。此外，用tech 99标记的二亚乙基三胺五乙酸酯也用于评估肺通透性，但结果不一。因此，上述差异以及放射性风险使这些分子的吸引力降低，进而检测领域转向了生物标志物。
肺上皮损伤的一种潜在生物标志物是痰或支气管肺泡灌洗液中club细胞分泌蛋白16（CC16）。CC16已在多种气道疾病中进行了研究，包括哮喘、COPD、特发性肺纤维化以及职业性或环境性肺损伤。但CC16是上皮损害的间接量度，而不是上皮渗透性。最近，血清连蛋白（zonulin）已成为评估慢性炎性疾病中上皮屏障功能的生物标志物。连蛋白被认定为人小肠上皮TJ的内源性调节剂，但连蛋白是否可以用作气道上皮通透性增加的生物标志物尚待阐明。目前尚未提出其他生物标记物来测量上/下呼吸道疾病中上皮通透性。因此，对鼻腔分泌物，痰液或支气管肺泡灌洗液进行大规模蛋白质组学的研究被批准。理想情况下，这些生物标记应该不可降解，大小合适以反映上皮的渗透性，并且易于检测。
新颖的成像技术，特别是利用共聚焦激光内窥镜检查，可以观察到气道中的细胞和间质结构，提示其潜在的应用前景。随着新型对比剂和高分辨率光纤的发展，分子成像技术可能有助于气道疾病的早期诊断或用于评估治疗效果。
针对上皮屏障缺陷的治疗可能是一种有吸引力的治疗策略。目前，没有食品和药物管理局批准的疗法，可以恢复或改善慢性气道疾病中增加的上皮通透性。但是，几种在小鼠体内外模型中重建上皮屏障功能的实验方法已有报道。这些方法侧重于调节TJ，在预防上/下呼吸道病理发作中具有潜力。我们发现皮质类固醇是哮喘，AR或CRS的标准治疗选择，在体内外小鼠哮喘模型中，能改善TJ功能并增加上皮完整性。此外，皮质类固醇可减少基底细胞增生，修复气道上皮的形态。
最近，基于表观遗传标记的疗法作为修复上皮屏障缺陷的新策略已被提出。阻断HDAC活性可增加哮喘患者原发性支气管上皮细胞和AR患者鼻上皮细胞的屏障功能和连接蛋白。此外，Fukuda等人表明，抑制癌细胞中HDAC可增强E-钙粘蛋白的表达，这对于上皮到间充质的转化非常重要。尽管通过表观遗传学以促进上皮屏障功能的想法很有吸引力，但复杂的机制和潜在的副作用仍需研究。
结论
气道上皮通透性增加是慢性上/下气道炎性疾病的关键特征。尚未明确，屏障功能障碍是发生于疾病发展之前还是导致疾病发展。但它确实通过促进变应原、病原体和有害刺激的细胞外转运，从而维持并促进粘膜气道炎症的慢性过程。上皮屏障相关的功能性和影像学技术的发展，将使我们能够在体评估粘膜气道通透性，帮助确定能够受益于屏障修复治疗的患者。气道屏障功能的保护或重建是呼吸系统疾病的新兴领域，值得进一步研究。
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