科研 |FOOD FUNCT：D-柠檬烯和潜在lncRNA化学预防靶点的LUAD转录组分析（国人佳作）
编译：小北，编辑：景行、江舜尧。
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D-柠檬烯是从柑橘油中提取的天然物质，据报道具有抗癌的疗效并且在癌症患者中预后良好。尽管作为癌症化学预防物质，人类中D-柠檬烯的转录图谱尚不清楚。基于转录图谱研究结果,发现一个命名为PDIA3P1的lncRNA受D-柠檬烯调节。在三个肺癌（LUAD）数据库中证实PDIA3P1是一个促癌基因。通过siRNA将PDIA3P1敲低后LUAD细胞的存活、侵袭、转移以及增殖显著降低。根据TCGA中LUAD数据库，研究者发现PDIA3P1调节的功能和信号通路主要包括脂肪代谢、免疫以及染色质结构的改变。本研究进行了D-柠檬烯对LUAD调节的全转录组分析，并且发现PDIA3P1可能作为一个调节因子通过脂肪代谢、免疫信号通路以及染色质结构的改变辅助D-柠檬烯预防和抑制LUAD。
论文ID
原名：LUAD transcriptomic profile analysis of D-limonene and potential lncRNA chemopreventive target
译名：D-柠檬烯和潜在lncRNA化学预防靶点的LUAD转录组分析
期刊：Food&Function
IF：4.171
发表时间：2020年8月
通讯作者：冯铁男
通讯作者单位：上海同仁医院
DOI号：10.1039/d0fo00809e
实验设计
结果
为了探究LUAD和D-柠檬烯背景下RNA的表达，研究者首先利用RNA-seq分析鉴定D-柠檬烯处理组与对照相比差异表达的RNA序列。D-柠檬烯导致73个基因表达上调，而59个基因表达下调（图1A）。这些基因在免疫相关信号通路中富集，例如应答病毒和细菌、IL-17信号通路以及应答细胞因子刺激物的调节。从细胞层面而言，这些基因调节细胞的增殖和细胞间通讯（图1B）。除了对细胞生长的调节功能，所有富集的功能分子都在一个调控网络内（图1C）。研究者挖掘了之前发表的RNA-seq数据(GSE86958)对癌症和良性肿瘤中差异表达的基因进行鉴定（图2A）。这些癌症相关的RNAs与D-柠檬烯处理改变的基因相关。12个在癌症中低表达的基因经D-柠檬烯处理后上调，而其他11个基因具有相反的特征（图2B）。基因同样在类型I干扰素信号通路中富集（图2C），同样发现IPA富集的结果（图2D）。
图2. D-柠檬烯对LUAD的影响。（A）LUAD恶性肿瘤和良性肿瘤差异表达基因的火山图；（B）D-柠檬烯调节的与LUAD相关的基因；（C）利用Metascape进行功能富集分析；（D）IPA功能富集分析。
2 D-柠檬烯对PDIA3P1的影响
除了GSE86958数据库中的结果，PDIA3P1的表达在另外两个LUAD数据库中也更高，肺癌和11位不吸烟女性邻近正常肺组织的转录组数据以及包含576个样本的TCGA数据库中肺癌和邻近正常肺组织的转录组数据（图3A）。经过D-柠檬烯处理的细胞系中，PDIA3P1的表达在三个细胞系中受到抑制，并且随着D-柠檬烯剂量的升高PDIA3P1的水平降低。24h后qRT-PCR的结果也证实，PDIA3P1的mRNA水平低于对照组（图3B）。CCK-8的结果说明D-柠檬烯能够抑制A549, H1975,以及PC9细胞的存活（图3C）。D-柠檬烯喂养的小鼠肺组织中PDIA3P1也受到抑制（图3D）。
图3. 不同条件下PDIA3P1的变化。（A）LUAD恶性肿瘤和良性肿瘤中PDIA3P1的差异表达；（B）不同D-柠檬烯条件下PDIA3P1的mRNA水平；（C）不同D-柠檬烯条件下克隆形成速率的改变；（D）D-柠檬烯处理动物组中PDIA3P1的水平。
3 PDIA3P1对肺癌发展的作用
研究者在A549, H1975,PC9细胞中转染了NC siRNA或者PDIA3P1 siRNAs，CCK-8的结果证实通过siRNA将PDIA3P1敲低后，A549, H1975, 以及PC9细胞的存活受到抑制（图4A）。此外，这三类细胞的侵袭、转移和增殖也同样在PDIA3P1沉默后受到抑制（图4B-D）。
图4. PDIA3P1的表型。（A）沉默PDIA3P1抑制LUAD细胞的存活；（B）沉默PDIA3P1抑制LUAD细胞的侵袭；（C）沉默PDIA3P1抑制LUAD细胞的转移；（D）沉默PDIA3P1抑制LUAD细胞的克隆形成。
4 PDIA3P1对LUAD的生物学功能
根据TCGA数据库，计算了可能受PDIA3P1调节的基因。利用KEGG信号通路数据库发现富集的信号通路主要是PPAR信号、胰岛素分泌相关以及肥胖代谢信号通路（图5A）。这些基因调节的基因本体论（GO）影响了分子之间的相互作用以及生物学活性。其中一些能够调控组织和细胞的存活、生长、分化、效应功能，以及管理类固醇的代谢等（图5B）。利用IPA工具，研究者发现了这些基因更多潜在的生物学功能（图5C、D）。其中FXR/RXR以及与内分泌和脂肪调节相关的糖尿病大都富集在IPA信号通路。Metascape的结果也说明这些基因参与的脂肪和免疫信号通路与PDIA3P1相关。这些信号通路包括由抗菌肽和中性脂质介导分解代谢的抗菌体液免疫反应。此外，这些基因通过HDAC去乙酰化的组蛋白调节染色质的结构。
图5. PDIA3P1的生物学功能。（A） PDIA3P1信号通路富集分析；（B） PDIA3P1的GO富集分析；（C） 功能分子之间的调控网络；（D） PDIA3P1的IPA富集分析；（E） 利用Metascape对PDIA3P1功能富集分析。
讨论
肺癌是全世界最常见的癌症死亡原因，每年大约100万人死于肺癌。目前为止，研究者仍在探究治疗癌症的方法。之前的研究无论是细胞实验、动物实验还是临床试验，都发现提取的D-柠檬烯消耗增加能够降低癌症发展的风险，或者提高存活时间，此外提取物包含90%的橘皮油。由于柑橘果皮中D-柠檬烯含量低，分离物主要被个体或者病人消耗。口服最大耐受的剂量为8 gm−2 day−1。有报道称D-柠檬烯在0.5 gm−2 day−1的剂量时能够终止中止癌症的发展。然而仍需要更大更全面的研究证实D-柠檬烯的有效性。动物实验也说明D-柠檬烯在乳腺癌、肝癌、肾癌以及皮肤癌中具有治疗效果。在多个癌症中受D-柠檬烯调节的一些生物学行为包括细胞周期停滞、凋亡诱导以及PI3K/Akt/mTOR和NF-κB信号通路的抑制。研究者在之前的报道中指出在肺癌中D-柠檬烯通过诱导自噬和凋亡表现出抗癌的活性。
LncRNAs是一组非蛋白编码的转录本，长度>200碱基，在正义链上与mRNA不同，它们的初级结构在不同物种间保守性很差，与mRNA相比表达水平较低，LncRNAs参与生理和病理的多个过程。然而大多数lncRNAs的分子功能还不清楚，越来越多的证据证实lncRNAs在细胞生物学和发育、炎症调控和免疫紊乱、以及脂肪代谢中发挥功能。此外，它们的异常调节可能导致多种疾病过程。从机制上而言，lncRNAs能够在转录水平调节基因的表达，从而调节局部表观图谱的改变。有报道称lncRNAs作为转录因子的诱饵，调节蛋白质的活性，包括癌症的病因。
在本研究中，研究者利用二代测序（NGS）的方法获取了LUAD细胞的整体表达图谱，样本分为经过D-柠檬烯和未处理的两组。随后对D-柠檬烯调控的lncRNAs进行了探究。最终研究者确定了D-柠檬烯对lncRNA的作用，并且在细胞系、动物实验以及肺癌患者数据库中分析了lncRNA的生物学功能。研究者发现促癌基因PDIA3P1 能够被D-柠檬烯抑制，PDIA3P1在LUAD细胞系和肿瘤样本中高表达，受D-柠檬烯抑制后，促进肿瘤进展的表型也受到抑制。这些结果表明PDIA3P1作为LUAD的促癌基因，是D-柠檬烯潜在的靶向之一。PDIA3P1可能调节胰岛素分泌/耐受的信号通路，有报道称人类胰岛素治疗过程中伴随高风险肺癌发生。PD1A3P1可作为LUAD早期诊断和预防的生物标记物。
结论
本研究通过D-柠檬烯对LUAD调节的全转录组分析发现，PDIA3P1可能作为一个调节因子通过脂肪代谢、免疫信号通路以及染色质结构的改变辅助D-柠檬烯预防和抑制LUAD。
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