综述 | TRENDS PLANT SCI：miRNA作为根际植物与微生物的相互作用关键媒介
编译：Mr. Left，编辑：景行、江舜尧。
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微生物在植物发育，营养和抗逆性方面非常重要，在共生有机体概念下，这种重要性促使科研人员对植物与微生物相互作用有了更全面的认识。植物微生物群落的结构通常被描述为宿主驱动的，尤其是在根际中，微生物群落由不同的根脱落物决定。逐渐地，这种观念开始消失，并被植物和微生物共同塑造植物微生物群的观念所取代。通过共同进化，植物和微生物建立了跨界的通讯渠道。在本文，作者提出miRNA是根际中植物与微生物相互作用和微生物群落形成的关键媒介。此外，作者建议，作为基于微生物菌剂的通常不成功策略的替代方法，miRNA可作为一种有前途的工具，可用于新型共生有机体工程。
论文ID
原名：Rhizospheric Plant–Microbe Interactions: miRNAs as a Key Mediator
译名：根际植物与微生物的相互作用：miRNA作为关键媒介
期刊：Trends in Plant Science
IF：14.416
发表时间：2020年10月
通讯作者：Harriet Middleton
通讯作者单位：雷恩大学
DOI号：10.1016/j.tplants.2020.09.005
主要内容
与植物相关的微生物对于植物至关重要：它们在植物发育，营养和对各种胁迫的抵抗力中具有至关重要的作用。值得注意的是，根际提供了一个多样的环境，其中与植物密切相关的各种微生物群落（包括有益植物的微生物）大量存在。植物及其相关微生物共同构成一个协调单元，称为共生有机体。为了保持这种联系的协调，有必要在微生物群落与植物内部以及它们之间进行某种形式的调节。目前，关于根际微生物群落的形成和组成动态的了解很少。通常认为，植物通过其根脱落物，尤其是其根系分泌物的影响来选择其微生物伙伴。但是，这种单向选择开始受到质疑。的确，植物-微生物共生有机体的协同进化表明存在双向通讯，尤其是根际微生物群落的形成。这些群落的组成和功能受到各种分子和信号的调节。在过去的几年中，作为跨界通讯的媒介，人们对小RNA（sRNA，背景图1），尤其是miRNA的兴趣日益增长。已有研究表明，通过胞外囊泡（EVs）的运输，哺乳动物宿主miRNA和膳食植物miRNA通过调节细菌基因表达和物种丰度来调节肠道菌群。就动物肠道菌群和植物根际菌群之间的共性而言，结合其在共生有机体营养和健康中的关键作用以及RNA“语言”的普遍性，miRNA在植物-根际微生物群落跨界相互作用中的意义似乎是合理的，但未被充分研究。
背景1：植物和微生物小RNA概述
植物产生各种sRNA，每种sRNA都能通过不同的沉默途径调节基因表达。这些21-24个核苷酸的RNA起源于发夹状前体或双链RNA（dsRNA），由RNA酶 III 类Dicer蛋白（DCL）加工而成形成sRNA双链体，在3'端具有2'-O-甲基化，然后将其加载到Argonaute（AGO）蛋白中，以发挥功能并抑制互补序列靶RNA的表达。植物sRNA包括小干扰RNA（siRNA）和miRNA。siRNA转录物通过RNA依赖性RNA聚合酶（RDRP）转化为长链dsRNA，然后由DCL蛋白加工成siRNA双链体。植物siRNA分为二级siRNA和异色siRNA（hetsiRNA）。它们参与转录后基因沉默（PTGS），但主要参与RNA指导的DNA甲基化（RdDM）和转录基因沉默（TGS）。由MIR基因编码的miRNA被RNA聚合酶II（Pol II）转录为发夹结构，即初级miRNA（pri-miRNA）。然后，DCL蛋白将pri-miRNA加工成较小的茎环结构，即前体miRNA（pre-miRNA），再由DCL蛋白加工，形成成熟的miRNA双链体（图I）。一旦加载到AGO蛋白中，形成多蛋白RNA诱导的沉默复合物（RISC），miRNA便可以通过mRNA切割或翻译抑制来抑制靶基因表达。 总之，植物sRNA，尤其是miRNA，参与许多调节过程，并在植物发育和逆境适应力中发挥重要作用。miRNA或milRNA的保守性及其在生命各个分支中的机制表明，它们对许多生物都很重要，并且它们作为跨界通讯的媒介可能发挥作用。例如，在根际中，植物与能够产生milRNA的多种微生物相互作用。与真核miRNA类似，人们已经发现了从发夹结构获得的细菌约22个核苷酸的RNA片段，即msRNA（图I），尽管它们的丰度表明期具有重要的功能，但其具体功能仍然未知。除msRNA之外，细菌还具有多种sRNA，主要特征是反式作用的sRNA和顺式作用的sRNA，但许多新的细菌小调控RNA尚待确定。真菌是真核生物，并具有多种sRNA；然而，它们是否产生miRNA仍在争论中。大多数研究表明，真菌中存在milRNA，而这些miRNA不是通过与真实miRNA相同的生物生成途径产生的（图1）。有趣的是，进化较古老的卵菌类谱系也有miRNAs。
背景图1. 植物和微生物中miRNA和类miRNA（mil）RNA生物发生的比较。该图比较了根际中miRNA的产生和种间交换（虚线箭头）。植物miRNA的生物合成途径已得到广泛研究，主要包括类Dicer蛋白（DCL）和Argonaute（AGO）蛋白。真菌通过至少四种不同的机制产生milRNA：在milRNA基因转录后，将初级（pri）-milRNA加工成成熟的milRNA参与酶的组合（由*表示），例如Dicer，QDE-2（一种Argonaute蛋白），MRPL3（RNA酶 III）和核酸外切酶QIP。有趣的是，存在一种独立于Dicer的miRNA生物发生途径，这为考虑缺乏Dicer酶但确实具有类Argonaute蛋白的细菌和古生菌中miRNA的产生提供了机会。尽管细菌msRNA生物发生的细节仍有待揭示，但多项研究已经预测了类似的发夹RNA前体，并被msRNA和msRNA*验证。这表明，RNA限制酶，如在大肠杆菌中发现的MazF，参与了msRNA的加工。一旦成熟miRNA被合成，许多问题仍然存在，关于它们在物种间的运动和功能：它们是在细胞外囊泡（EVs）和/或外膜囊泡(OMVs)中运输吗？它们是与AGO蛋白质结合还是自由运动？植物miRNA在微生物群中的作用是什么？目标微生物基因是什么？目的是什么？这种调节是如何塑造微生物群的呢？真菌的小RNA已被证明使用植物AGO蛋白来沉默宿主基因，尽管还不清楚细菌是否也使用这一机制。
在本文中，作者提出EVs转运的miRNA构成植物及其相关根际微生物之间的跨界双向通信通道（图1）。由植物miRNA与肠微生物群之间以及植物miRNA与病原体之间的联系的实验证据支持，作者提出miRNA与根际微生物群的丰度，组成，功能和活性的形成有关。
图1. 通过交换包含小RNA（sRNA）的胞外囊泡（EVs）的根际相互作用模型。植物-微生物在根际相互作用的一个表示:宿主植物的选择能力通过根际沉积物（蓝色）被证明，它在形成微生物区系中起着重要的作用。根际沉积物的形式和功能多种多样，允许与其他生物及其环境进行信号转导。微生物在根际的发育依赖于这些化合物，并在一定程度上受到它们的调节，因为微生物优先以某些根际沉积物为底物。反过来，微生物产生各种各样的信号分子（橙色），例如挥发性有机化合物、植物激素、群体感应分子等等，这些都可以被植物感知。作者认为植物和微生物也可以通过EVs进行交流，EVs中含有sRNAs，尤其是miRNA或类miRNA（mil）RNA。含有miRNA的宿主植物EVs（绿色部分）可以通过调节群落组成和活性来调节微生物基因的表达（粗体绿色箭头表示miRNA介导的调控效果）。微生物也可以通过其含有miRNA的EVs（紫色部分）调控寄主植物基因表达，从而控制其邻近环境和植物适应度（粗紫色箭头）。此外，根际微生物群成员也可能通过含有小RNA的EVs相互作用，并与其他微生物群落相互作用（黑色虚线箭头）。
2 什么塑造了根际微生物群？
从生命开始，作为种子，再到从根到芽的整个发育阶段，植物在内部和外部都被微生物包围和定殖。这些微生物在植物生存和生长中的重要作用已被人们完全接受，并进行了详尽的综述。此外，与植物相关的微生物可使植物更好地适应环境。植物微生物群不仅可以通过水平传播从环境中获取，而且可以通过垂直传播直接从亲本种子中获取养分。人们对微生物在环境中获取以及其在植物共生有机体中组装的规律知之甚少。通常认为，在块状土壤的根部渗透过程中，土壤微生物群通过与根脱落物接触而逐渐分化为根际微生物群，根脱落物通过例如具有抗微生物特性或通过作为底物，极大地影响了微生物群的组成。在第一次群落变化之后，不仅以区域化特异性方式（即，内球，根面或根际）微调微生物群组成，而且还取决于宿主基因型。实际上，由植物遗传因素决定的特征，例如根系形态和根系分泌物的质量和数量，可以塑造根际微生物群。另外，其他因素，例如植物免疫系统，植物发育阶段和季节，也被证明与根际微生物群的形成有关。无论土壤来源和施肥方式如何，某些植物中核心微生物群的存在进一步表明，这些群落的组成和选择至少部分是由植物驱动的。
尽管根际微生物群落的组成似乎主要是选择的结果，但更重要的是要考虑群落组成的其他过程：扩散，漂移和形态。研究表明这些过程在植物发育过程中不同程度地调节根际微生物群落的建立。微生物群及其功能多样性的变化并不是宿主植物选择的新微生物菌株的唯一结果。共生有机体的这种变化也是特定微生物扩增/还原和水平基因转移（HGT）的结果。这三个过程的结合可以使植物共生有机体迅速适应具有挑战性和不断变化的环境。在许多研究中都观察到了从原始微生物群落到专门针对这种情况的群落的转变。例如，在干旱胁迫下，水稻根系微生物群落组成的变化以某些细菌类群的特异性富集为特征，这些细菌类群被称为植物促生菌（PGPR）和/或抗干旱胁迫细菌。由于干旱胁迫，根系分泌物的变化是某些微生物选择性富集的原因。除了改变微生物组成外，胁迫条件还会影响根际中的微生物活性。在碳氢化合物污染的土壤中，微生物的组成和活性都可以通过微生物的特化来调节，例如，通过选择性富集碳氢化合物降解菌和PGPR或刺激已经存在的微生物中特定的微生物活性（例如烃降解）。
根际微生物群的调节不仅由植物驱动，而且还由微生物自身驱动。实际上，它们可以调节植物的环境，甚至可以通过植物激素，挥发性有机化合物，群集感应分子和抗菌素的渗出对植物重新编程以发挥其优势。根际微生物群的形成还基于微生物代谢物底物的偏好和微生物成员之间的相互作用。微生物相互作用可以基于协作机制，例如营养缺乏条件下的群体感应和代谢物交换，也可以基于竞争机制，例如抗微生物化合物的分泌，但是尚不清楚哪种相互作用主导群落。总体而言，微生物相互作用可以诱导通讯的微生物内部基因表达的改变。因此，微生物相互作用既可以调节微生物群的形成又可以调节其功能。基于它们在调节与植物相关的微生物群落中的作用，有人认为共生菌是共生有机体的生态工程师。因此，除了植物对根际微生物群的调节之外，根际中微生物相互作用在构造植物微生物群中也具有重要作用。
3 miRNA在双向跨界通讯中的作用
在宿主植物和相关微生物之间，存在一个持续的双向对话，适应于跨界通讯（背景2）。一个著名的例子是在根瘤菌-豆类共生的建立过程中，植物产生的黄酮类化合物诱导细菌的结瘤基因，导致Nod因子的分泌，进而引发根瘤的形成，根瘤中的根瘤菌将固定大气中的氮并将其转移到植物中。如前所述，在根际中交换了大量的信号分子。有趣的是，用于与寄主植物通讯的大多数微生物信号分子也是微生物间通讯的一部分。这些化合物会影响植物的发育或免疫系统，因此这些信号可能会使微生物群控制植物，或者植物已经进化出可以感知它们的能力。关于共生有机体概念，这两种可能性可以共存，因为宿主与其微生物之间存在持续的双向通讯。
背景2：全基因组理论下的植物-微生物相互作用
全基因组理论认为，共生有机体的基因组组合（如植物基因组和相关微生物基因组）是受自然选择影响的生物单元之一。这一概念主要基于以下事实:（i）所有动植物都与多种微生物有关：（ii）这些微生物的一部分在共生有机体世代之间传播;（iii）宿主与微生物群的相互作用影响共生有机体的适应度。这个理论可以解释基因变异在共生有机体发生的速度:微生物群的进化速度非常快，这是由于较短的世代、水平基因转移（HGT）和新微生物在群落中的出现。宿主和其微生物群之间建立的牢固纽带，加上微生物进化的力量，一定会对共生有机体的共同进化和宏观进化机制产生重大影响。就植物共生有机体而言，植物和微生物之间的共同进化表明存在跨界双向通讯。从根际微生物群的多样性和动态变化来看，宿主植物很可能只与其根际微生物群的一部分即核心微生物群共同进化，核心微生物群通常具有稳定性和可遗传给后代的特征。然而，这些双向的相互作用允许通过包括植物和微生物在共生有机体适应度中的基本作用来调节全基因组。
在过去的几年中，跨界通讯的研究蓬勃发展，尤其是关于宿主-微生物群相互作用及其对人类健康的影响。在这种通讯的各种可能的媒介中，sRNA，更具体地说是miRNA，引起了越来越多的兴趣。
miRNA是一类小的非编码RNA（约21个核苷酸），通过抑制翻译或直接切割靶mRNA参与调控基因表达。miRNA首先在线虫中发现，然后在从鱼类到苍蝇和哺乳动物的生物体中得到鉴定，从而突显了它们在整个动物界的存在。此后不久，首次在拟南芥中报道了植物miRNA，然后在真菌中鉴定了类miRNA的RNA（milRNA）。
以前认为miRNA与多细胞生物一起出现，其功能仅限于单个生物内的细胞间通讯。后来，在单细胞生物中还发现了miRNA或milRNA：首先是在莱茵衣藻中，然后在卵菌和细菌中，后者被称为miRNA尺寸大小的小RNA（msRNA）。单细胞生物中milRNA的发现表明，基于miRNA的基因调控是一种古老的机制，可能早在多细胞生命出现之前就已出现。miRNA或至少非常相似的分子在整个生命的所有分支中确实在进化上得到了很好的保守和产生。而且，miRNA不仅限于组织，器官或生物体内的细胞间通讯：它们可以在个体之间甚至从一个物种到另一个物种进行长距离运输。关于其他信号转导化合物，古老而广泛的RNA“语言”特别适合跨界通讯，因为所有基于RNA调节的生物都在使用它：RNA提供了一个普遍保守的，稳定的通讯渠道。miRNA作为这种通讯的媒介，由纳米囊泡（通常称为EVs）转运，尽管术语外膜泡（OMVs）有时用于革兰氏阴性细菌。在真核细胞中，EVs源自多泡体与质膜的融合，而细菌EVs或OMVs是通过细菌外膜的外生芽产生的。这些囊泡不仅对RNA，而且对蛋白质和脂质起保护性运输的作用。在封装之前，将这些分子选择性地分类到EVs或OMVs中，表明具有功能靶向性。跨界miRNA交换已在多种物种和相互作用中被报道（表1）。许多研究集中在宿主与病原体的相互作用上，通常侧重于sRNA介导的RNAi机制，这是许多病原体共有的保守毒力机制，可以抑制宿主免疫，而宿主可以靶向病原体中与毒力相关的基因。哺乳动物与细菌之间，线虫与哺乳动物之间，植物与真菌之间，植物与昆虫之间以及寄生植物与寄主植物之间的这种宿主-病原体相互作用得到了证实。在拟南芥与真菌病原体灰葡萄孢之间第一次报道了通过sRNA运输产生的实际双向跨界RNAi。
但是，现在越来越多的研究突显了miRNA交换在非致病性关系中的作用，其中许多研究集中在肠道中宿主与微生物的相互作用上。实际上，已有研究显示来自肠上皮细胞的宿主miRNA通过特异性进入某些细菌并调节一系列管家和糖降解基因的转录，从而影响肠道菌群的组成，进而影响细菌的生长。有趣的是，被摄入的植物会在肠道中释放EVs，某些目标细菌会优先吸收EVs及其中的植物miRNA，从而诱导其基因表达的修饰。继而，它们的代谢物的产生和分泌可能被改变，从而导致与这些靶细菌相互作用的细菌种类的差异变化。因此，被摄入的植物能够通过基于miRNA的通讯来塑造哺乳动物的肠道菌群，部分解释了饮食对肠道菌群的影响。
考虑到宿主miRNA和植物miRNA对肠道菌群的影响方面的这些最新进展，作者提出植物及其根际菌群也可以通过miRNA进行通讯，从而调节根际微生物的组成和活性。此外，最近研究显示，细菌囊泡不仅可以将其DNA携带到其他细菌中，而且还可以携带到宿主真核细胞中。因此，很容易想到，msRNA也以这种方式被传递，并可能介导跨界通讯。植物miRNA具有组织特异性，在根组织中有数百种；因此，通过与周围其他生物共同进化而选择的这些子集很可能会通过根际中的EVs排出。
4 共生有机体工程和当前的RNAi应用
在当前的共生有机体时代，微生物在塑造自身群落的作用，以及植物的影响，正日益引起人们的关注。在生态工程等许多领域，科学家的目标是成功地对植物的微生物群进行工程改造，以优化植物共生有机体提供的生态系统服务。全球许多生物技术公司已经做出了重大努力，创建包含精心选择的微生物的特定菌剂，以提高农作物的产量。但是，这些方法中有许多无法有效地从实验室转移到田间：接种的微生物可能会与当地群落竞争，或者在能够稳定地建立自身群落之前就被冲走。接种非本地物种也引发了有关潜在入侵物种的问题。因此，微生物组工程学正在慢慢演变为“共生有机体工程学”，该技术已被用于农业实践中，例如嫁接，有机农场或粗放耕作以及包括微生物群的植物育种策略。目前正在开发整体生物技术，例如基于土壤记忆或合成微生物组的方法。作者建议这些共生有机体工程技术也可以基于跨界的通讯媒介，例如miRNA。
跨界的RNAi技术已经用于作物保护，并且已经进行了深入研究，尤其是宿主诱导的基因沉默（HIGS），它使用能够表达针对病原体特定基因的sRNA或双链RNA（dsRNA）的转基因植物。但是，HIGS需要使用转基因植物具有争议性，甚至在某些国家被禁止。为了解决这些问题，环境RNAi迅速出现：将sRNA或dsRNA直接应用于宿主植物，导致病原体中特定基因的沉默和疾病控制。这些环境RNAi方法被称为喷雾诱导基因沉默（SIGS）。但是，SIGS技术仍处于起步阶段，并遇到许多问题，例如渗透性，应用效果和生产成本：因此，目前市场上还没有基于SIGS的可用产品。
另外，使用miRNA编码的肽（miPEP）作为扩增特定植物miRNA表达的工具可能是一种有趣的方法。miPEP是在植物pri-miRNA中编码的小调节肽，能够增强其相应miRNA的转录并导致靶标mRNA的较强抑制。当将合成的miPEP171b应用于蒺藜苜蓿时，miRNA171b的表达增加，并导致丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis的菌根化作用增强。如果作者提出的假设，即在植物及其根际微生物群之间miRNA的交换被证实，那么使用miPEP刺激某些有益植物microRNA的合成和释放对于生态工程中的许多领域来说可能是有前途的工具。实际上，miPEP可以间接调节根际微生物群，而无需添加外源菌剂。而且，miPEP的应用非常简单，不需要进行遗传转化，这使miPEP技术成为共生有机体工程的令人振奋的途径。
总结与展望
鉴于目前对宿主和植物miRNA在肠道菌群组成和活性中的作用，RNA“语言”的普遍性以及RNAi技术的潜力的了解，作者认为miRNA至少部分地影响了根际微生物群。这种观点意味着基于miRNA的微生物群落操纵在农业，林业和环境修复方面具有巨大潜力。但是，需要更多的基础研究来探究miRNA在植物与微生物之间的意义，尤其是植物miRNA对根际微生物群落的影响。如果发现此假设是正确的，那么关于对植物-微生物相互作用和共生有机体工程可能性的理解的观点将开辟一个新的领域，然而仍有许多悬而未决的问题。
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