论文：PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis（PRMT1介导的微处理机相关蛋白甲基化调控微RNA生物发生）

摘要

微RNA(MiRNA)生物发生是由微处理机及其相关蛋白的活性作用于细胞核内的一个受严格控制的多步过程。

通过高分辨率质谱(MS)-蛋白质组学，我们发现该复合物被广泛甲基化，其中84个甲基化位点与其24个亚基中的19个相关联。大多数修饰发生在精氨酸(R)残基(61)上，导致81个甲基化事件，而30个赖氨酸(K)甲基化事件发生在复合物的23个位点上。

有趣的是，I型蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMTs)的耗竭和药物抑制都会导致复合物甲基化状态的广泛改变，并导致miRNA表达的全球下降，这是miRNA处理前一步的损伤所致。

特别是，我们发现，微处理机亚基ILF 3甲基化的降低与其与pri-miRNAs miR-15a/16、miR-17-92、miR-301和miR-331的结合减弱有关。我们的研究揭示了R-甲基化在哺乳动物细胞miRNA生物发生调控中的作用。

最不发达国家甲基蛋白质组的深度表征

为了对最不发达国家发生的甲基化进行深入的注释，我们将该复合物的亲和富集与重甲基(Hm)SILAC标记和质谱蛋白质组学相结合。

蛋氨酸是细胞中的一种必需氨基酸，是细胞的前体。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，酶甲基化反应中甲基基团的唯一供体.在hmSILAC环境下，细胞在含有重同位素变异的蛋氨酸的培养基中生长，光盘3-蛋氨酸(Met4)。

摄取后，Met4被细胞内转换为光盘3-SAM，作为赖氨酸-(K)和精氨酸-(R)甲基转移酶的重甲基基供体，使底物蛋白变成重甲基标记。

当与高分辨率MS相结合时，该策略允许以很高的置信度进行区分。体内R和K上的甲基化事件，这些事件来自错误的阳性识别，如化学甲基化，或与此修改相同的氨基酸替换。

事实上，在质谱光谱中，重甲基化的肽会产生同位素肽链对，其中重和轻的峰因独特的质量差(deltamass，Δ质量)而不同，这取决于所添加的甲基基团的数量。

为了评估不对称的R-di甲基化是否调节最不发达国家的活性，我们研究了PTM的改变是否会影响miRNA的生物发生。针对PRMT 1在Ⅰ型PRMT家族中的优势活性，我们利用插入于慢病毒结构中的两种不同的短发夹RNA(ShRNAs)，通过RNA干扰产生敲除(KD)HeLa细胞。

两种shRNAs在细胞转导过程中均观察到蛋白质水平的下降。至感染后96h，PRMT 1缺失细胞的生长与空白载体(EV)介导的对照细胞相似。而在随后的时间点，KD细胞在小鼠体内的生长逐渐减少，直到完全停止，根据报告的PRMT 1丢失导致胚胎死亡的情况。

为了研究PRMT 1缺失对miRNA表达水平的影响，我们首先监测了miR-15a/16和miR-17-92，其解除管制已经与缺乏一些微处理器相关蛋白。我们观察到来自这两个簇的成熟miRNAs的下调，这种作用在感染后72h达到高峰。

然后，我们用Taqman人miRNA卡对感染后72小时的对照细胞和PRMT 1 KD细胞的miRNA水平进行了全局分析，采用小RNAseq和定量PCR方法。

我们观察到一种普遍的mirna下调，只有一小部分未改变或上调的mirna。这种对miRNAs的影响并不是由小核仁RNA(NoRNAs)的变化所反映的。表明PRMT 1的缺失对其他细胞的ncRNA没有影响。

最不发达国家的主要功能是将核pri-miRNAs切割成较短的前miRNAs。因此，我们试图研究在PRMT 1耗尽时观察到的全球miRNA下降是否是由于这一催化步骤的特定损伤引起的。

我们设计了定量实时PCR(QPCR)引物，以区分pri-和成熟的miRNAs。我们不仅分析了miR-15a/16和miR-17-92簇，其成熟水平以前曾被评估过，而且根据小RNAseq和Taqman分析，我们还分析了两个最受抑制的miRNAs，miR-301 a和miR-331。

4种pri-miRNAs的水平在rmt 1耗尽时没有变化，甚至增加。而预先和成熟的miRNAs显著减少。

为了证实这一证据，我们还分析了来自miR-15a/16和17-92团簇的pri-和premiRNAs在细胞核进一步分馏成染色质和核仁时的情况，因为pri-miRNAs更多地与染色质有关，而预miRNA在它们的细胞质输出之前被释放在核液中。

通过分析染色质部分的pri-miRNAs和核仁中的premiRNAs，我们证实premiRNAs在rmt 1 kD上被下调，而相应的pri miRNAs则保持不变。

PRMT 1依赖的R-甲基化在miRNA生物发生中的新作用与其他修饰最不发达国家的PTM相似，即磷酸化和乙酰化，后者调节miRNAs的胞内水平，以响应内外刺激。

有趣的是，PRMTs在几种癌症中是不受调控的尤其是PRMT 1过表达与肿瘤进展呈正相关。此外，最近的一项研究表明，包括PRMT 1在内的Ⅰ型PRMTs的过度表达促进了小鼠乳腺肿瘤的发生。

同样，微RNA在癌症中的表达也经常被改变，这些分子可以显示致癌或抑制肿瘤的功能。此外，参与miRNA生物发生的蛋白质，如DROSHA和Dgcr 8，也在肿瘤中被发现突变和去调控。

证实了异常的最不发达国家功能、改变的miRNA水平与癌症进展之间的联系。

在这种情况下，miRNA生物发生依赖于R-甲基化，并可被PRMT抑制剂调控，这一事实允许推测利用PRMTs的药物抑制来解决与miRNA处理和调控相关的肿瘤脆弱性的可能性，为癌症治疗提供了新的治疗选择。

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