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在这篇文献中作者旨在揭示编码CCT亚基用于预后的关键基因并建立预后基因模型。首先，从TCGA、ICGC和GEO下载数据集，比较肿瘤与正常组织之间的CCT亚基基因表达水平。根据相应的Kaplan-Meier分析显示，CCT亚基基因的总体存活率存在明显差异。随后作者进行了相关性分析，PPI网络，基因本体分析，免疫细胞浸润分析和转录因子网络，构建了列线图以预测预后。同时，基于多元Cox回归分析以及线性回归模型的收缩和选择方法，最后，作者验证了由3个CCT相关基因组成的3基因预后签名和列线图，结果表明，该签名可以作为肝癌的生存预测和新的生物标志物。
本文看似一个基因家族分子，其实也就是几个单基因的分析结果堆在一起。
对于单基因的分析，挑选基因最为关键。小编认为容易发表的基因要符合以下几点（符合条件越多越好）：
1 在多种肿瘤中该基因高表达
2 在多种肿瘤中该基因高表达的患者预后差
3 在多种肿瘤中该基因在高分期表达较高
4 不同肿瘤中的富集分析有比较集中的几种结果
5 在一种或者多种肿瘤中与特定免疫细胞浸润相关，如巨噬细胞，CD8T细胞等
6 最好用不同的方法证明5中的结论
7 在某一种或者几种肿瘤中集中于一些免疫相关基因相关性高
8 该基因最好报道过，但是又研究较少，有一定新颖性
如果能筛选到这样的基因，再添加单基因的各种层面分析，肯定是比较容易接收的。能再加一些实验验证就更好不过了。另外，我们也推出了最新的单基因泛癌高阶套路。详见：
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发表杂志：Front Genet.
影响因子：3.258 即时影响因子：4.42
伴侣蛋白的TCP-1亚基基因组对肝细胞癌的预后能力
一、研究背景
肝细胞癌（HCC）是全球第七大常见肿瘤和第三大癌症相关死亡原因之一。外科治疗是最常用的治疗方法，但其预后不佳。肝癌也是一种生物异质性恶性肿瘤，其细胞和分子机制鲜为人知，这限制了治疗功效的提高。因此，迫切需要鉴定分子生物标志物以改善预后预测，并协助开发可能的新疗法。含有TCP-1（T-复合蛋白1）的伴侣蛋白是一种大分子复合物，包含9个亚基，它的功能已在多种肿瘤中进行了研究。
二、流程图
三、分析解读
1、患者数据下载和样本采集
①从TCGA-LIHC、ICGC-LIRI-JP和GEO-GSE14520中下载肝癌患者转录组数据和临床数据。
来自ICGC和GSE14520队列被视为测试集。
②比较了来自TCGA（下图A）和ICGC（下图B）组的HCC患者的肿瘤和非肿瘤组织之间的CCT亚单位（TCP1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6A、CCT6A、CCT6B、CCT7、CCT8）基因表达水平。
③CCT亚单位基因表达水平与TCGA和ICGC（下图F）队列中低和高阶段（下图C）、等级（下图D）和T级（下图E）的比较。
结果显示：
①三期TCP1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6A、CCT7和CCT8的表达水平明显高于TCGA组的一二期。
②CCT6B的表达水平在三期和四期明显低于TCGA队列的一期和二期。
③随着T分期的增加，CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6A、CCT7和CCT8的表达水平显著提高。
2、CCT亚单位基因生存分析
①在TCGA组的HCC患者中进行CCT基因表达的Kaplan-Meier分析
②在ICGC组的HCC患者中进行CCT基因表达的Kaplan-Meier分析
结果显示：
①TCP1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6A、CCT7和CCT8的高表达与TCGA和ICGC队列的HCC患者的预后较差。
②CCT6B的高表达与TCGA和ICGC队列中更好的整体生存显著相关。
3、CCT基因表达水平相关性分析
①确定TCGA和ICGC数据中所有CCT基因的pearson相关系数（下图A,B）
②利用GeneMANIA数据库构建了PPI网络(下图C)
③CCT亚单位蛋白的基因本体论和通路富集分析（下图C,D）
结果显示：
①9种CCT蛋白也与其他蛋白质相关联
②CCT基因的基因本体分析显示，与未折叠的蛋白质结合，蛋白质定位到核体，蛋白质定位到端粒的建立和蛋白质定位到Cajal体相关的生物途径的富集。
4、CCT基因的单因素和多因素分析
①采用单因素分析法分析了TCGA数据库中年龄，性别，分期，TNM和CCT基因与预后相关的临床特征，与ICGC队列中一致（下图）
②对两个队列中的每个CCT基因和临床特征进行了多因素Cox回归分析（下图）
结果表明：
①TCP1，CCT2，CCT3，CCT4，CCT5，CCT6A，CCT6B，CCT7，CCT8和阶段与HCC的预后有显着相关性。
②每个CCT基因均与TCGA队列中的生存率显着相关
③在ICGC队列中，CCT基因与总体存活率显着相关。
5、CCT基因表达与免疫细胞浸润
①使用TIMER数据库用于评估CCT基因表达与六种免疫细胞浸润之间的相关性，包括B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树突状细胞。
②探索了TCP1和CCT2/3/4/5/6A/7/8异常表达与巨噬细胞相关的总体生存率的相关性。
结果显示：
①CCT基因与B细胞，CD4+T细胞，CD8+T细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞和树突状细胞呈正相关（下图）。
②TCP1和CCT2/3/4/5/6A/7/8与巨噬细胞显示出很强的相关性（下图）。
③TCP1或CCT2/3/4/5/6A/7/8高表达且巨噬细胞得分高的组的总体生存期最差（下图）
6、转录因子调控网络的构建
①分析了HCC和邻近非癌组织中前30个转录因子的表达（下图A）。
②通过单因素Cox回归获得了18种与生存有关的总体转录因子（下图B）
③建立了详细的调控网络，将转录因子与CCT基因联系起来（下图C）。
结果表明：PA2G4，CEBPZ，PRMT3，YBX1和CENPA在参与TCP1，CCT2/3/4/5/6A/7/8转录中可能起更重要的作用。
7、基于CCT基因表达的预后基因集
①为了建立预测特征，对训练集中的CCT基因（TCP1，CCT2，CCT3，CCT4，CCT5，CCT6A，CCT6B，CCT7和CCT8）进行Lasso模型处理（下图A）。
②通过多变量Cox比例风险回归选择这些基因用于下一步模型构建（下图B）
③构建了风险评分：风险评分=（0.013805×CCT4的表达水平）+（0.015096×CCT6A的表达水平）+（-0.74942×CCT6B的表达水平）。通过计算验证和测试集中每位患者的风险评分，使用中位数将患者分为低风险组和高风险组（下图）。
结果表明：
①显示了根据风险评分分类的患者，绿色表示风险评分低于中位数的患者，红色表示风险评分高于中位数的患者（下图A）
②内部和外部验证集中观察到了相似的结果（下图B，C）
③Kaplan-Meier分析表明，在训练，验证和测试集中，高风险组的患者预后比低风险组的患者差（下图D-F）。
④训练，验证和测试集中的预后模型ROC曲线显示出良好的预测能力（下图G–I）。
⑤与TCGA组的存活患者相比，HCC患者的风险评分较高（下图A)
⑥TNM 分期、等级分期和T 分期的风险评分显著增加（下图B-D)
⑦在ICGC队列中观察到了同样的趋势（下图E，F)
8、基因预后模型的单因素和多因素分析
①在训练，验证和测试集中进行了预后模型的单变量和多变量Cox回归模型。
②在训练和验证集中，包括了根据3个基因的特征计算出的年龄，性别，等级，阶段和风险评分（下图A，B为单因素Cox回归；下图D，E为多因素Cox回归分析）。
③在测试集中，包括了性别，年龄，分期，先前的恶性肿瘤以及根据预后模型计算出的风险评分（下图C为单因素Cox回归；下图F为多因素Cox回归分析）。
结果表明：从预后模型计算的分期和风险评分是总体生存的独立预后因素（P <0.05）。
9、构造和评估列线图
①使用TCGA队列中的预后模型和其他临床特征构建列线图以预测1年，3年和5年生存（下图A）。
②校准曲线显示列线图的校准相对较好，接近最佳预测值（下图B）。
③进行ROC固化以评估列线图的预测效率，组合列线图的AUC分别为0.71、0.72和0.71，分别用于预测1年，3年，5年生存（下图C）。
④与单独的风险评分或阶段相比，组合模型显示出更大的效果（下图D）
9、实验验证CCT4和CCT6A的表达
为了进一步验证CCT4，CCT6B和CCT6A的表达，通过定量PCR研究了其转录本在肝癌细胞和正常肝细胞系中的相对表达。
结果显示：与正常肝细胞LO2相比，HCC细胞HepG2中CCT4，CCT6B和CCT6A的表达水平显着上调（下图）
小结：
在本文章中，作者研究确定了9个CCT亚基基因（TCP1，CCT2，CCT3，CCT4，CCT5，CCT6A，CCT6B，CCT7，CCT8）是HCC患者生存的独立预后因子。同时发现CCT亚基基因异常表达与免疫细胞浸润有关，特别是与巨噬细胞有关，CCT亚基基因高表达和巨噬细胞评分高的肝癌患者预后不良。经过多因素Cox比例风险回归和LASSO模型，作者开发并验证了一种新的3基因预后模型（包括CCT4，CCT6A，CCT6B），该预后模型与HCC患者的生存率显著相关。基于单因素和多因素分析，作者又建立了一个结合了预后模型的列线图，这些结果在训练，验证和测试集中是一致的，表明预后模型的准确性。