FLEX条件性表达慢病毒载体（Cre-Off）是什么？

FLEX Cre-Off系统由两对异型Lox-变体重组位点组成，其中野生型序列称为LoxP，突变体称为Lox2272，分别位于ORF的两侧。 两种Lox-变体都可被Cre识别，但只有相同的Lox位点对可以彼此重组，与其他Lox-变体不能进行重组。 LoxP和Lox2272位点以交替方式位于ORF两端，每对位点互为反向。Cre重组酶不存在的情况下，客户定制的启动子可以驱动目的基因的正常表达。Cre重组酶存在的情况下，LoxP和Lox2272位点对分别重组，导致ORF方向反转为反向，且其中的一对重组位点将具有相同的方向，Cre会介导产生正向重组切割，继而分别留下一个不同的重组位点。ORF方向的反转，使得目的基因无法正常表达。由于ORF侧翼是两个不同的Lox-变体位点，所以即使存在Cre也不会进一步发生重组。

慢病毒载体首先以质粒的方式构建并使用E. coli扩增，然后与多个辅助质粒一同转染至包装细胞。载体上的两个LTR区域之间的DNA序列将被转录成RNA，而辅助质粒表达的病毒蛋白进一步与这些RNA组装形成完整的病毒颗粒。有活性的病毒颗粒被释放到上清液中。病毒上清液可直接转染或者浓缩后转染细胞。

当病毒感染靶细胞时，病毒RNA被反转录成DNA，然后永久性整合到宿主基因组。位于两个LTR区域之间的FLEX Cre-Off开关连同其他病毒基因组组分永久整合到宿主基因组。在Cre重组酶的介导下，自定义启动子调控下的目的基因的反转ORF编码方向从而实现目的基因的表达沉默。

通过改造优化，我们的慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因（这些基因由辅助质粒进行表达，用于病毒包装过程），使产生的慢病毒颗粒是复制缺陷型的。即包装的病毒只具有转导靶细胞的能力，而无法在靶细胞中进行大量复制，因而具有很高的生物安全性。