CRISPR载体（单gRNA）是什么？

CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9）核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一（另外两种是ZFN和TALEN），可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。这些质粒载体编码的特异性RNA，能够引导DNA核酸酶（或缺刻酶）编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。为了方便使用，我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引导RNA（gRNA）。

我们的CRISPR/Cas9表达载体中有两种Cas9核酸酶供选择，一种是标准的人源化Cas9（hCas9），能够有效地在靶位点产生双链断裂（DSBs）；另一种是“缺刻酶”（Cas9_D10A），仅在DNA中产生单链切割。如果将Cas9_D10A缺刻酶与靶向两条互补链的两个gRNA一起使用，缺刻酶会在两条链上产生单链切割，从而导致靶位点处产生DSB。这种方法通常会减少CRISPR/Cas9脱靶效应，因为它需要两个gRNA同时靶向靶位点。

细胞通过非同源末端连接途径（NHEJ）修复通常会产生小的片段或碱基缺失，插入和碱基置换等突变。当这些突变破坏蛋白质编码区（例如引起移码缺失）时，会引起功能性基因敲除。在少数情况下，CRISPR/Cas9载体和外源供体DNA模板共同导入细胞时，细胞会通过同源性修复（HDR）机制来修复DSB，靶基因DNA序列会被模板序列取代，碱基发生改变，如点突变等。缺刻基因组DNA也会经常发生同源修复（HDR），如将外源模板DNA与Cas9_D10A缺刻酶一起导入细胞中，有可能产生碱基改变。

利用CRISPR/Cas9系统可以有效靶向大部分DNA序列，而NGG（有时是NAG）是必须的。NGG叫做前间区序列邻近基序（PAM），位于靶DNA，gRNA识别序列的3'末端。