背景：天使综合征(Angelman syndrome，AS)是一种严重的神经发育障碍，由基因UBE3A缺失或15号染色体15q11-q13缺失引起，15号染色体包含UBE3A和其他几个基因，包括GABRB3、GABRA5、GABRG3，编码γ-氨基丁酸A型受体亚基(β3、α5、γ3)。基因缺失的个体通常比其他基因型的受损更严重，但潜在的病理生理学仍然在很大程度上未知。本文，我们使用EEG来检验位于15q11-q13上的UBE3A以及其他的基因导致AS基因型之间的病理生理差异的假说。方法：我们比较了缺失基因型(37例)或非缺失基因型(21例)导致天使症的儿童(1-18岁)和正常发育的无天使症儿童(48例)的EEG的功率。结果：我们发现与非缺失基因型相比，缺失基因型的theta功率(峰值频率：5.3 Hz)升高和beta功率(峰值频率：23 Hz)降低，以及两种基因型的1-32 Hz范围内的delta峰值频率(峰值频率：2.8 Hz)的增加，但在年龄较小的缺失基因型个体中增加更大。结论：我们的结果为non-UBE3A神经元病理生理学在AS缺失中的作用提供了强有力的证据，并提示GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇的半合子导致异常的theta和beta振荡，这可能是更严重的临床表型的基础。我们的工作提高了对AS病理生理学的理解，并对AS治疗方法和生物标志物的发展具有直接意义。本文发表在Biological Psychiatry杂志。（可添加微信号siyingyxf或18983979082获取原文及补充材料）。关键词：Angelman syndrome, Biomarkers, EEG, GABA, GABRB3-GABRA5-GABRG3 gene cluster, UBE3AAS是一种罕见的遗传性神经发育障碍，发病率为万分之一至1/2.4万。AS的临床特征包括整体发育迟缓、智力障碍、小头畸形、癫痫、睡眠困难，以及一些与自闭症相重叠的表型。神经元中缺乏功能性泛素蛋白连接酶E3A (UBE3A)是AS核心特征的基础，点突变个体的表型证明了这一基因的单独影响。UBE3A是由15号染色体上的同名基因UBE3A编码的，通常仅在神经元的母体等位基因中表达，但在其他细胞类型中双等位基因表达。UBE3A功能障碍的下游后果尚不清楚，但AS的临床前小鼠模型显示树突形态改变和突触功能受损，这可能是EEG整体电生理异常的基础。这些临床前发现与AS个体的神经病理学病例研究一致，这些病例表明，皮质锥体神经元细胞异常，包括分布不规则，树突分枝减少，树突棘数量减少，以及EEG明显异常。尽管有这些异常，但总体脑结构并不是特别异常。AS病因可分为两大类(图1)。第一类为非缺失型AS，主要影响UBE3A的功能。非缺失型AS占所有AS病例的25% ~ 30%，包括UBE3A突变、印迹缺陷和父系二体。第二类为缺失型AS，是指15号染色体15q11-q13处的缺失。缺失的长度各不相同，但都包含UBE3A，以及大约11至15个其他蛋白编码基因，许多小的核仁RNA基因，以及具有潜在功能意义的非编码区域。缺失型AS占大多数(约70%)。在这里，我们用‘基因型’来指代上述两种病因组。
图1：15q11-q13原理图解。母系表达基因(即神经元中父系印迹基因)UBE3A用红色表示，父系表达基因(即神经元中母系印迹基因)用蓝色表示。黑色为非印迹基因(即双等位基因表达)；n表示不同基因型的参与者人数。UBE3A突变(n = 10)，父系单亲二体(UPD) (n = 4)，印迹缺陷(n = 5；可能是印迹中心内的删除或异常的表观遗传印迹)，非缺失的异常DNA甲基化(可能是UPD或印迹缺陷，n = 2)主要影响UBE3A。在我们的研究中，这些病因包括非缺失基因型(n = 21)。注意，UPD还具有父系印迹基因的双等位基因表达(蓝色)。15q11-q13的缺失通常在图中所示的典型断点(BPs)之间。I类缺失是从BP1到BP3的大约6Mb（n=10），与II类(大约5Mb)缺失相比，I类包括着丝粒附近的四个额外基因，II类缺失从BP2到BP3（n=24）。与非典型(n = 2)和未知(n = 1)缺失类型一起，I类和II类缺失构成了我们研究中的基因型缺失(n = 37)。这两个缺失类别都包含γ氨基丁酸A型受体β3-α5-γ3亚基基因簇(即GABRB3, GABRA5和GABRG3)，这是解释我们的结果的核心。缺失型AS比非缺失型AS个体有更严重的临床表现，这表明，除了UBE3A，其他的基因缺失增加了疾病的严重程度。然而，AS基因型之间的病理生理学差异仍然在很大程度上未知。15q11-q13缺失包括GABRB3 GABRA5 GABRG3基因簇，该基因簇编码β3、α5、γ3 -氨基丁酸A型(GABAA)受体亚基。鉴于GABA-氨基丁酸能系统在大脑发育和功能中的重要作用，GABAA受体亚基基因的缺失可能导致AS基因型的重要差异。事实上，有几个证据支持这一观点：1)Gabrb3敲除的小鼠重现了AS样表型(包括癫痫发作和EEG异常)；2) AS缺失既表明三个GABAA受体亚基基因的皮质表达改变，也表明皮质GABAA受体密度降低，同时也表现出严重异常的体感诱发反应，可能与GABA能功能障碍有关；3)染色体15q11.2-q13.1重复(dup15q)综合征(一种以智力残疾、自闭症和癫痫为特征的神经发育障碍)是由15q11.2-q13.1重复引起的，具有过多beta振荡为特征的EEG表型。这些振荡与GABAA受体增强药物(如苯二氮平类药物)的EEG特征非常相似，因此提示GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇在dup15q综合征的病理和表型中起作用。考虑到GABA系统在形成神经元动力学，包括振荡过程中至关重要，EEG应该提供一个合适的工具来捕捉缺失的GABAA受体相关异常。AS的特征是有强烈且异常的EEG。Vendrame等人在115名AS患者的大样本中描述了EEG异常(在这里，我们分析了这些人的一个子集），发现了间歇性delta振荡(83.5%)，发作间期的癫痫样放电(74.2%)，间歇性theta振荡(43.5%)，和后脑区慢波(43.5%)。最近，Sidorov等人使用了AS EEG的定量分析，证明了delta频段的功率过大。然而，这些作为AS EEG异常的基因型缺失和非缺失均有报道。比较缺失和非缺失的EEG差异，可能为UBE3A和非UBE3A神经元病理生理学的各自贡献提供有价值的见解，但尚未进行定量研究。本文比较了缺失型AS和非缺失型AS的脑电功率谱。考虑上述证据，我们测试了关于缺失型AS的两个具体假设：1)更大的delta功率，2)较小的beta功率。此外，还对其他频段做了数据驱动的探索性分析。AS组来自之前分析过的AS自然发展研究的数据集，控制组儿童（TD）来自波士顿儿童医院，无神经病学或者发育障碍。这里提供的数据来自儿童和青少年，即年龄在12 - 21个月(1-18岁)的参与者在清醒状态下的记录。由于许多参与者的年龄和发展能力有限等，排除了遵从一般研究指导语的可能性，即觉醒状态并没有进一步控制眼睛状况(例如，眼睛睁开或闭上)。总共有144个数据集进入了预处理。对19导电极先带通滤波0.5-45Hz，然后视觉检测伪迹、坏导并排除分析，由于数据质量较差，10个数据被排除，采用ICA用来删除剩余伪迹，最后，删除的坏导采用插值替补法，并全脑平均参考，最终的数据有106个被试（127个EEG记录），每个数据有15.9±8.36分钟的数据。采用对数尺度计算功率谱，范围1-32Hz，采用Morlet小波，绝对功率计算公式为:
delta：1.5-4，theta：4-8。也报告了两个频段内的质心值（center of mass）。P ~ 1+基因型+年龄+基因型:年龄+(1|被试)P是某个频段的log功率，年龄是log2变换的且做了中心化（我们使用对数变换年龄来解释儿童发展的非线性变化率，即在更小的年龄时更快的发展变化。），基因型是类别变量[AS，TD]，[缺失，非缺失]，或[缺失类型I，缺失类型II]。为了获得95%的置信区间用于说明和检验特定的假设，我们在LMMs内使用了t检验。为了检验因素(如基因型或年龄)的相关性，我们使用嵌套模型之间的对数似然比检验。为了矫正不同频率分析时的多次比较，我们额外应用了置换检验方法。最后，为了评估delta功率的稳定性，我们使用了来自于超过一次访问的参与者的前两次访问的类内相关系数。我们获得了儿童和青少年(1-18岁)清醒状态下AS和TD对照组的EEG数据。经过预处理和质量控制，我们保留了来自37个缺失型AS个体(10名女性参与者)的49个数据集，21个非缺失型AS个体的30个数据集(6名女性参与者)，以及48个TD对照参与者(22名女性参与者)的单次访问数据集（图1）。在AS样本中有男性参与者的过度表达，与TD对照组参与者相比接近显著性(p = .054)。这很可能是偶然的，因为AS是一种常染色体疾病，在性别之间的患病率没有已知的差异。重要的是，AS基因型之间的性别比例没有差异(p = 0.90)，与以前的报告一致，患有AS的参与者表现出整体发育迟缓、语言障碍和癫痫。平均年龄（AS缺失：4.6±3.0，AS非缺失：7.3±3.3，TD控制组：8.8±5.0）在AS基因型之间，AS和TD之间差异显著，之后的分析控制年龄。本研究发现，AS和TD在所有频率（1-32Hz）上差异都显著。AS的功率比TD在所有频率上都更高（图2A，图S 2A）。差异最大的地方在delta范围（峰值频率PF=2.8Hz），且在所有电极上都是如此，但差异最大的脑区在颞叶电极（图2B C，图S 2B）。
图2：AS（天使症）和TD（正常发育）个体之间的功率谱差异。
（A）组平均的功率谱图，阴影是95%置信区间。
（B、C）B是AS相对于TD组的delta（2.8Hz）功率的相对变化的地形图。C是效应量大小（Cohen’s d）。
（D）从线性混合模型获得通道平均的delta功率(2.8 Hz)的发展轨迹。
图S 2：AS（天使症）和TD（正常发育）个体之间的功率谱差异。
（A）采用LMM获得组平均功率谱，与图2A相同，但功率的尺度不是log尺度。
（B）AS相对于TD组的delta峰值频率（2.8Hz）功率变化百分比。
（C）通道平均的delta功率的发展轨迹，控制了年龄。而AS组的ICC的计算只使用前两次测量的EEG（一些被试多于2次）为0.68（95%的CI是0.31-0.88），表明中等程度的稳定性。
（D）总功率（1-32Hz）的发展轨迹的分析。
总共16个AS被试有至少2个不同时段的EEG评估，可以用来研究稳定性，发现delta功率有中等程度的稳定性（ICC：0.68）（S图2C）。尽管最大差异主要在delta功率，但对总功率(即在所有频率上的总的功率)在AS组和TD组之间也产生了相似的效应量（表S2，图S2 D）。
表S2：AS和TD的总功率（1-32Hz）的LMM分析。P ~ 1+基因型+年龄+基因型:年龄+(1|被试)，基因型是AS或TD，功率是10log10（总功率的平方）。SE是均值的标准误，DF是自由度，用Satterwaite近似估计，高低95%的CI。在典型的发育过程中，EEG在所有频率上的绝对功率都随着年龄的增长而下降，而在较高频率上的相对功率(>8 Hz)在增加。接下来，我们根据功率和峰值频率，即表征振荡过程的两个关键量，研究AS 的delta功率的发展轨迹。随着年龄的增长，两组AS组的功率峰值均显著下降（图2D）。两组的斜率差异不显著。在58名AS患者中的54名患者的70份EEG记录中发现了清晰的delta峰值，delta峰值频率与年龄无关(LMM中有无年龄模型的对数似然比检验，p = 0.492)。质心（Center of mass），一个量化主要频率的替代指标，也显示与年龄无关(频率范围：1.5- 4 Hz, p = 0.832)。因此，AS中过量的脑电delta功率在发展过程中以与TD对照组相似的速度减少，因此在整个发展过程中保持在较高的基线。
图S5：单独标记AS参与者通道平均功率谱上的峰值(在纵向数据中，每次访问都单独进行标记)。在delta和theta频段手动标记峰值。如果手动选择的峰值与使用局部最大值的自动方法的差异小于5%，则使用自动峰值标记代替。（A）单独标记的delta (1.5-4 Hz)峰值在缺失型AS(绿色)和非缺失型AS表现(蓝色)的参与者的频谱上用红点表示。我们在58名参与者中的54人的79份EEG中发现了70份的delta峰值。（B）单独标记的theta (4-8hz)峰值在被排除的缺失型AS(绿色)的参与者的频谱上用红点表示。我们发现34名缺失型者中的28人的46份EEG中有37份出现了theta峰(只考虑I类和II类)。delta频率范围内的过多的功率与之前AS中与TD控制参与者相比的过多的相对delta功率的报告一致。我们的结果表明，AS的功率在分析的所有频率(1-32 Hz)中都有所增加，并且在delta频率范围内表现出最强的差异。因此，与相对功率比较而言，绝对功率的效应量更大(绝对功率：Cohen’s d = 1.22，相对功率：Cohen’s d = 0.67；delta峰值频率为2.8 Hz)。为了研究AS亚型EEG功率的表型差异，我们将AS组分为缺失型AS (n = 34, I类或II类缺失)和非缺失型AS (n = 21)亚组。首先，我们测试了引言中提到的两个具体假设。在AS组水平的峰值频率(2.8 Hz)上比较缺失型AS[假设1]的功率显示，在4.7岁的平均log2年龄，缺失型AS的功率比非缺失型AS高2.97 dB(对应198.3%的功率)（图3A）。功率的差异随着年龄的增长而下降，并且在颞叶最大(图3B, C)。在4.7岁的平均log2年龄上，比较2种基因型的beta功率，显示出缺失型AS比非缺失AS低1.69 dB的功率(相当于67.7%)[假设2；23 Hz]（图4A）。在23Hz时，中央区的功率差异最大(图4B, C)。因此，缺失型AS比非缺失型表现出更强的delta功率，但更弱的beta功率。
（A）由LMM(所有电极平均)得出的delta功率(2.8 Hz)的发展轨迹。AS缺失型(Del)用绿色表示，非缺失型(Non-Del)用蓝色表示。（B,C）B是缺失相对于非缺失的功率变化，C是t检验的p值。
（A）由LMM(所有电极平均)得出的beta功率(23 Hz)的发展轨迹。缺失型(Del)用绿色表示，非缺失型(Non-Del)用蓝色表示。（B,C）B是缺失相对于非缺失的功率变化，C是t检验的p值。
图5：AS基因型间的功率谱差异
（A）来自LMM的组平均功率谱。缺失型AS(Del)用绿色表示，非缺失型(Non-Del)用蓝色表示。彩色条带显示95%的置信区间。黑条表示具有显著组差异的频率范围。
（B）缺失和非缺失之间的功率谱差异。
（C）来自LMM的组平均theta功率（5.3Hz）的差异（平均所有电极）。
（D）theta峰值频率和年龄的相关。
（E-G）E是缺失相对于非缺失AS个体的功率变化，F是效应量，G是p值。
（A）用于在有和没有AS基因型信息的模型之间的比较(对数似然比检验)。水平线表示不同的统计阈值。（B）同图3A，但功率不是log尺度。黑线表示组间差异显著的频率范围。（E）发展变化中的缺失型AS和非缺失AS之间的斜率差异地形图。接下来，我们进行了探索性分析，并在全频率范围内以无偏和数据驱动的方式测试基因型差异。该分析显示，与非缺失AS相比，缺失AS的theta频带功率为5.20 dB，以5.3 Hz为中心(相当于非缺失AS值的331%)（图5A，图S A-C）。theta功率只对缺失AS存在局部极大值，对非缺失AS不存在局部极大值。5.3Hz的功率最大差异在颞中区（图5E-G）。综上所述，这些结果表明缺失AS的EEG表型表现为theta频率范围内的振荡，而非缺失AS则没有这种振荡。然后，我们根据功率和峰值频率研究了缺失型AS的theta功率的发育轨迹（图5C）。我们发现随着年龄的增长，缺失型AS的theta值(5.3 Hz)显著下降，但非缺失型AS不是这样。这表明缺失型AS theta值的发展在下降。然而，AS组间的斜率没有显著差异（图S 4E）。在34名I类或II类缺失型AS的被试中，有28人的37份EEG记录显示出清晰的theta峰(非典型缺失的受试者除外)（图S 5B）。对于有theta峰值的参与者，我们发现随着年龄的增长，theta峰值频率显著增加0.31（图5D）。因此，缺失型AS个体的theta功率在发展过程中是增加的。缺失型AS可以进一步细分为不同的亚组[类I：~6 Mb：类II：~5 Mb；我们从分析中排除了罕见的缺失]。然而，当加入缺失型亚组信息时，我们并没有发现一个改进的模型拟合(p<0.05，对数似然比检验)。值得注意的是，两个缺失亚组都包含GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇。这表明，引起AS缺失和非缺失之间差异的基因位于I类和II类缺失共享的区域。为了检查药物引起的潜在混淆因素，我们对参与者服用的所有药物进行了分类：1)主要作用于中枢神经系统，2)对中枢神经系统有副作用。医生对药物进行分类，进一步对中枢神经系统药物进行分类：抗癫痫药、抗精神病药、alpha激动剂和兴奋剂。对于每个类别和子类别，我们计算了每个基因型的参与者在我们分析中使用的至少一次EEG记录期间服用药物的比例。卡方检验没有显示AS基因型之间的差异，这表明EEG的差异反映的是病理生理学的差异，而不是药物的差异。我们的研究结果表明，在儿童AS中存在一种强大的电生理表型，并揭示了缺失和非缺失基因型之间的几种频率特异性差异。接下来，我们总结了表型差异，将其与GABAergic信号联系起来，并讨论EEG作为生物标志物的实际意义过量的delta振荡是一个强大的UBE3A相关的AS表型我们发现EEG表型中最显著的是过多的delta振荡。这一结果与临床上观察到的AS脑电活动异常相一致。我们的结果在几个方面扩展了先前的工作。首先，我们发现脑电功率在一个较宽的频率范围内(即所有分析的频率，1-32Hz)都有所提高，因此，与相对功率相比，绝对功率可以更好地分离AS和TD。脑电图信号功率的这种频率非特异性增加的起源尚不清楚，也不清楚它是否与神经生理学或解剖学异常有关(例如，改变的组织电导率；虽然AS的体细胞和头部生长相对正常)。其次，我们描述了一个广泛的年龄范围(1-18岁)的发展轨迹，并表明delta功率增加(相对于TD对照组)在整个发展过程中是稳定的。第三，我们发现在年龄较小时，与非缺失相比，delta在缺失组的增加更明显，尽管未来的研究需要更好的年龄匹配数据来详细说明这一发现。最后，我们发现AS的delta功率增加在全脑都很普遍，但在颞叶电极上最强。delta表型的病理生理机制尚不清楚；尽管如此，我们的结果提供了一些见解。观察到的delta表型在缺失和非缺失中都存在，这表明它是由UBE3A中断的下游效应驱动的。例如，通过中断UBE3A依赖的GABA转运体1降解(GAT1)而受损的紧张性GABA能抑制可能是delta表型的基础。然而，无论是临床前还是临床都已证实，UBE3A的缺乏导致细胞异常和突触功能受损，而这反过来又可能在观察到的异常delta活动中表现出来。theta和beta振荡表明了缺失型AS中的非UBE3A的病理生理学，这暗示了GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇的作用首先，我们证实了引言中提出的假设，与非缺失型AS相比，缺失型AS的beta功率减小。这建立在最近对dup15q综合征的研究上，表明beta活动反映了三个GABAA受体亚基基因(GABRA5, GABRB3和GABRG3)的基因剂量效应，表现为GABAA受体密度的改变，从而改变网络动力学。这些beta频段的变化可能反映了皮层组织中反复出现的兴奋-抑制反馈回路的异常，并与GABAA受体调节剂的药理作用很一致。值得注意的是，在dup15q综合征和AS中，beta调制的空间结构是非常不同的（图4B,C）。如果某些大脑区域的beta振荡可以上调，但不能下调，而其他大脑区域的beta振荡可以下调，但不能进一步上调，这可能是可以预期的。虽然我们的发现背后的皮层网络还不清楚，但缺失型AS个体显示了低beta活动，这增加了针对GABAA受体的理论基础，这种神经发育障碍会影响GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇(如：AS、Prader-Willi综合征、dup15q综合征)。然而，AS基因型之间最显著的差异是我们的假设没有预料到的：theta频率范围内的振荡活动，这只存在于缺失型AS中。在AS中的theta活动已经在以前的出版物中定性地描述过了，但就我们所知，我们的工作是第一次量化过剩的theta振荡，并将它们与缺失型AS联系起来。鉴于GABAA受体在反映EEG振荡的神经元动力学的形成中起着至关重要的作用，GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇的缺失是我们研究中观察到的AS基因型差异最可能的原因。然而，我们不能排除除GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇之外的两个缺失基因型的共同基因，尽管与这些其他基因相关的EEG效应尚不清楚。如上所述，我们的结果表明GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇的缺失是缺失和非缺失型AS电生理差异的基础。GABAA受体假说提供了具体的、可证伪的预测。举例来说，我们的工作是有关EEG异常的可预测研究，这些EEG异常在Prader-Willi综合症（神经发生障碍病，由父亲15 q11-q13缺失或母亲15号染色体单亲二体引起）也可以观测到。了解AS的EEG表型对治疗的发展也有重要的实际意义。对于一种潜在治疗方法的成功临床开发，量化疾病病理生理学和提供治疗反应的客观指标的生物标志物是至关重要的。EEG已被认为是一种有前途的定量、鲁棒和可理解的AS生物标志物。特异性作用于UBE3A表达的高靶向性治疗需要生物标志物来证明靶向参与和治疗效果。我们的发现指出delta的异常可作为UBE3A的病理生理学相关证据，而theta和beta来自其他基因，最有可能是GABRB3-GABRA5-GABRG3基因簇。因此，如果治疗的主要靶点是UBE3A的再表达，则应探索EEG delta功率作为生物标志物，而如果GABAA受体为靶点，则应考虑theta和beta功率作为生物标志物。我们的结果表明，编码GABAA受体亚单位的基因半合子调节UBE3A相关的电生理表型，并导致广泛的皮质动力学变化，表现为振荡神经元活动的频谱特异性异常。这些电生理异常可能是AS缺失更严重的行为表型的基础。我们的工作对EEG作为AS治疗发展中的生物标志物具有直接意义。
