尤文肉瘤的CAR-T治疗研究进展
尤文肉瘤（EWS）是一种骨或软组织的恶性肿瘤，主要发生在儿童和年轻人中，是继骨肉瘤之后第二常见的原发性骨肿瘤。传统治疗，包括积极的新辅助治疗和辅助化疗结合手术和/或放疗，极大地提高了患者的长期生存率，5年生存率超过70%。然而，一旦肿瘤细胞转移或复发，患者往往表现出较差的预后。
在过去十几年中，新的免疫疗法层出不穷，如免疫检查点阻断剂、治疗性癌症疫苗等。其中，CAR-T疗法是一种变革性的治疗方法，它通过基因工程在T细胞表达合成嵌合抗原受体（CAR），目前成为全球范围癌症治疗的“常规” 手段。
最近，CAR-T疗法也被用于实体瘤，其中也包括在原发性骨肿瘤中的应用。CAR-T疗法可能在这些EWS患者中发挥优越的抗肿瘤作用。
CARs由四个组成部分组成：细胞外抗原识别结构域，最常见的是单链可变片段（scFv）；结构成分，如铰链和跨膜结构域；提供维持CAR-T细胞效应器功能的共刺激信号结构域，以及CD3ζ 激活域。
第一代CARs通常只包含CD3-ζ链信号转导结构域。将一个共刺激分子添加到第一代CARs中产生了所谓的第二代CARs，而第三代CARs包括将两个共刺激分子添加到第一代CARs中。这种方法不仅使免疫细胞具有靶向性，而且可以克服免疫耐受困境，使修饰后的免疫细胞具有较强的抗肿瘤活性。
基于CAR-T细胞的疗法显示出强大的抗肿瘤活性，而不受传统主要组织相容性复合体（MHC）的限制。移植后，CAR-T细胞可以大量增殖，并表现出持久的抗肿瘤活性。
CAR-T细胞在肿瘤治疗中的有效应用要求对肿瘤细胞具有特异性，因此，寻找肿瘤特异性抗原是一项非常重要的任务。目前，EWS中确定的靶点包括VEGFR2、IGF1R、ROR1、GD2、B7-H3（CD276）、EphA2和NKG2D配体。这些受体可作为CAR-T细胞治疗EWS和抑制转移的有效治疗靶点。
VEGFR2
血管内皮生长因子（VEGF）是一种内皮细胞特异性有丝分裂原，可诱导生理和病理性血管生成。VEGF受体（VEGFRs）包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3三种类型，其中VEGFR2在调节内皮细胞VEGF信号传导中起主要作用。VEGF介导的信号通路已被证明存在于肿瘤细胞中，并且在肿瘤发生中起着关键作用。
在一项临床前研究中，VEGFR2特异性CAR-T细胞能有效地裂解VEGFR2阳性细胞，并产生有效的抗原特异性脱颗粒反应、细胞因子分泌和增殖反应。因此，VEGFR2可能是EWS中CAR-T细胞治疗的合适靶点。VEGFR2靶向的CAR-T细胞已用于转移性黑色素瘤和上皮癌的早期临床试验（NCT01218867），但目前的结果显示临床反应较差。因此，进一步研究VEGF信号通路对EWS治疗的作用至关重要。
IGF1R
IGF1R是一种四聚体跨膜受体酪氨酸激酶。配体与IGF1Rα亚单位的结合导致β亚单位的自磷酸化和衔接蛋白的招募，最终导致信号级联的激活，进而促进增殖、存活、转化、转移和血管生成。由于IGF1R在EWS中表达，许多实验将其用作EWS治疗的免疫靶点。
一项体外研究表明，IGF1R靶向的CAR-T细胞表现出特异性细胞毒性，主要释放针对肉瘤的IFN-γ、TNF-α和IL-13。此外，IGF1R靶向的CAR-T细胞也有利于局部肉瘤模型的延长生存期。尽管IGF1R靶向的CAR-T细胞具有一定的抗肿瘤活性，但IGF1R也在正常组织中表达，尚不清楚它们是否对身体有任何毒副作用。
在EWS的一项II期研究中，研究人员发现患者在使用ganitumab（一种全人抗IGF1R抗体）治疗后出现了诸如中性粒细胞减少和白细胞减少等不良事件。据报道，淋巴细胞和单核细胞的细胞表面IGF1R表达均较低，这使得它们不易被IGF1R靶向的CAR-T细胞识别。此外，可通过改变CAR-T细胞对靶细胞的亲和力或调整CAR-T细胞的治疗剂量来解决靶外毒性。然而，在实现其临床应用之前，应该对IGF1RCAR-T细胞的非靶向毒性进行系统评估。
ROR 1
ROR1是二十个不同的RTK家族之一，由三个不同的细胞外结构域组成，包括免疫球蛋白样结构域、富含半胱氨酸（CRD）和Kringle（KNG）结构域以及细胞内TK结构域。ROR1在正常人组织中不表达，但在几种人类恶性肿瘤中过度表达，可能作为肿瘤细胞的生存因子。
ROR1靶向CAR-T细胞的体外和体内抗肉瘤活性已得到了证实，此外，ROR1靶向CAR-T细胞的安全性已在灵长类动物中进行了验证。然而，最近的研究表明，ROR1的表达并不特定于肿瘤组织。已经在人类甲状旁腺、胰岛和肠道的几个区域观察到细胞表面ROR1，并且在胃窦和胃体中尤其丰富。
Shivani Srivastava等人设计了一种逻辑门控ROR1CAR-T，可以解决靶向外毒性问题。在这种设计中，CAR-T细胞活性仅消除同时表达抗原A和B的肿瘤。针对抗原A的合成Notch受体可诱导针对特异性抗原B的CAR表达，通过整合多种信号来调节T细胞功能，从而可以更精确地区分肿瘤组织和正常组织。尽管上述研究已证明ROR1靶向的CAR-T细胞在治疗EWS方面具有一定的疗效，但ROR1靶向的CAR-T细胞尚未进入临床试验，最新进展正在进行招募（NCT02706392），其显示出巨大的发展潜力。
GD2
GD2是一种具有严格限制表达模式的细胞表面分子，在EWS中高度表达。由于GD2在正常组织中的分布有限，因此免疫靶向是安全的。一项研究证明了GD2靶向的CAR-T细胞对EWS细胞具有强大的细胞溶解反应，另一项研究也证实了GD2靶向CAR-T细胞对EWS的抗肿瘤活性。
然而，其他研究表明，仅GD2靶向的CAR-T细胞不能消除转移性或原位注射的EWS细胞。在一项I期研究中，研究人员使用GD2靶向CAR-T细胞治疗神经母细胞瘤患者，发现单独使用GD2靶向CAR-T细胞治疗没有客观的临床反应。因此，增强GD2靶向CAR-T细胞的抗肿瘤作用是其成功临床应用的关键。一种策略是将GD2与其他可行靶点结合，构建表达多种CAR的T细胞。另一种方法可以将GD2靶向的CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂结合，以提高疗效。
B7-H3（CD276）
B7-H3是B7免疫调节蛋白家族的成员，在多种实体瘤细胞过表达。B7蛋白与CD28/CTLA-4家族成员结合，在T细胞激活中作为共刺激信号。此外，B7-H3在病理性血管生成过程中过度表达，这可能使其成为选择性破坏肿瘤血管系统的有吸引力的靶点。
近年来，利用B7-H3靶向CAR-T细胞治疗实体瘤受到了广泛关注。在胰腺导管腺癌、卵巢癌和神经母细胞瘤小鼠模型的体外原位和转移异种移植物中，B7-H3靶向CAR-T细胞显示出良好的疗效，没有明显的不良反应。
Robbie GM等人尝试使用B7-H3靶向的CAR-T细胞治疗儿童实体瘤。他们发现，超过90%的受试儿童肉瘤存在B7-H3和EWS的高表达。进一步的实验表明，B7-H3靶向的CAR-T细胞可以在体内消灭EWS异种移植物，与小鼠治疗对照组相比，具有显著的生存优势。因此，B7-H3靶向CAR-T细胞可能是治疗EWS的可行选择。
此外，B7-H3靶向CAR-T细胞与免疫检查点抑制剂或传统化疗药物的联合似乎是一种可行的选择。
EphA2
Eph家族成员参与细胞转化、转移和血管生成。有两类Eph受体配体：ephrin-A和ephrin-B。EphA2在多种癌症中过表达，包括乳腺癌、黑色素瘤和前列腺癌。相关研究表明EphA2在EWS细胞中上调，并参与内皮细胞向肿瘤的迁移，以协助肿瘤血管生成。
研究表明，EphA2靶向的CAR-T细胞能有效杀死小鼠的EWS细胞，并与延长存活时间有关。然而，只有一小部分EWS细胞表达EphA2，EphA2CAR-T细胞在小鼠中表现出的抗肿瘤活性可能主要通过作用于肿瘤血管生成来影响EWS的生长和转移。
NKG2D
NKG2D是一种由自然杀伤（NK）细胞和T细胞表达的强大激活受体。近年来，NKG2D及其配体在EWS中的作用越来越受到关注。
Manfred Lehner等人通过慢病毒转导或mRNA转染构建了NKG2D特异性CAR-T细胞，这些CAR-T细胞在体外可以有效地消除EWS细胞。此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂可上调EWS中NKG2D配体的表达。因此，NKG2D特异性CAR-T细胞和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的组合被认为是EWS的有效治疗方法。
CAR-T细胞治疗是一种很有前途的免疫治疗方法，对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果令人鼓舞。同时，人们也对CAR-T细胞治疗实体瘤充满了期待，EWS是一种侵袭性的儿童癌症，CAR-T疗法可能在EWS患者中发挥优越的抗肿瘤作用。一些CAR-T细胞治疗EWS的研究已经取得了一些令人鼓舞的进展。
目前，用于CAR-T细胞的抗原表位主要包括VEGFR2、IGF1R、ROR1、GD2、B7-H3、EphA2和NKG2D。尽管针对这些靶点的CAR-T细胞在体外或体内临床前模型中表现出抗肿瘤活性，但这些靶点也有其局限性，如靶点外毒性、作用不足和低表达，大多数研究还处于早期，离临床应用还较远。
解决以上问题，CAR-T细胞治疗应该注意以下几个方面：首先，寻找对肿瘤更具特异性的靶点；其次，当靶点在肿瘤细胞中高表达而在正常细胞中低表达时，通过控制治疗阈值可以减少对正常组织的损伤。第三，可以调整CARs和同源抗原之间的亲和力以实现靶向性。
针对CAR-T细胞治疗的障碍，如肿瘤穿透、抗杀伤、抗原逃逸和免疫抑制，可以从以下几个方面加以解决。1）CAR-T细胞可以被设计成表达趋化因子受体，以识别TME中上调的趋化因子，从而增加CAR-T细胞的浸润。2）CAR-T细胞与常规疗法或免疫检查点抑制剂的结合可能值得探索。3）构建表达多个CAR的免疫细胞或结合多个CAR-T细胞可提供更高的肿瘤细胞破坏效率。4）可以将更多的共刺激表达受体引入CAR-T细胞，并且可以构建靶向肿瘤抗原和免疫抑制细胞因子或TME中的免疫抑制细胞的CAR-T细胞，以抵抗对T细胞的肿瘤免疫抑制作用。5）联合某些药物可以通过表观遗传学上调肿瘤中抗原的表达，并增强CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用。
参考文献：
1.A Novel Treatment forEwing’s Sarcoma: Chimeric Antigen Receptor-T Cell Therapy. Front Immunol. 2021;12: 707211.