IPSC细胞基因编辑有哪些应用范围？
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建基因敲除、点突变和敲入诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs) ，可为多种疾病的发生和治疗提供有效的研究模型。那IPS细胞的基因编辑有哪些应用范围呢？如何应用基因敲除的IPS细胞开展相关实验呢？让我们一起来看一些文献案例，为大家的实验设计打开思路吧~
CISH-/- iPSC-NK细胞提高抗肿瘤活性
研究人员将供体的皮肤或血细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSC），然后再定向分化为NK细胞（iPSC-NK细胞），在iPSC-NK细胞中利用CRISPR/Cas9技术将CISH基因敲除，该基因调控含SH2蛋白的表达（CIS；CISH的蛋白产物），CIS是信号传导的关键负调控因子。研究结果表明，CISH-/- iPSC-NK细胞在白血病异种移植模型中，敲除后的NK细胞增强了对肿瘤生长的抑制，而且敲除后的NK细胞在体内的持久性也显著增加了。CISH的缺失增强了NK细胞的功能，CIS通过调节人类 NK细胞代谢活性从而在抗肿瘤活性方面起着关键作用。
图1. 从人类iPSC中构建CISH-/- iPSC-NK细胞[1]
iPSC技术用于ASD发病机制研究
自闭症谱系障碍 （ASD） 是一种复杂性的神经发育障碍性疾病，在表型和遗传上具有异质性。研究人员通过插入蛋白质标签和提前终止密码子，为iPSC细胞系中10个功能不同的ASD风险基因设计了完全敲除的基因编辑策略（AFF2/FMR2, ANOS1, ASTN2, ATRX, CACNA1C, CHD8, DLGAP2, KCNQ2, SCN2A, TENM1），且所有突变都在相同的“等基因”（遗传背景相同）中产生，以此研究ASD风险基因的基因功能。将KO iPSC细胞诱导分化为兴奋性神经元，采用RNA测序对诱导分化神经元的转录特性进行研究，揭示了几个神经元网络的融合。同时使用膜片钳和多电极阵列方法，发现不同突变的电生理缺陷是不同的，但它们最终会导致突触活动持续减少。尽管ASD易感基因属于不同的基因本体，但等基因的干细胞可以揭示常见的功能表型，例如神经元连接功能降低。鉴于ASD的异质性，这类基于CRISPR等基因的敲除系统可能对逐步控制的细胞表型实验是必不可少的。
图2. iPSC细胞的KO与相关基因检测[2]
在iPSC衍生的人类类器官疾病模型中研究miRs失调的病理途径
microRNA （miRs） 是一类非编码小RNA，它们在发育和生理背景下具有重要的调节作用。Kung等在人类iPSC细胞中敲除了miR-26b茎环基因，以探索miR-26b在发育和疾病中的作用。该基因编辑的细胞系表现出正常的核型，表达多能性标记并分化为三个胚层的细胞。这为研究发育提供了一个良好的实验模型，并阐明了iPSC衍生的人类类器官疾病模型中miR-26b下游调节异常的病理途径。
图3. iPSC细胞中miR-26b的敲除与鉴定[3]
F9基因敲入的iPSC细胞用于血友病治疗
目前对血友病的标准治疗方案是细胞替代疗法，虽然有效，但存在一定的病毒感染的风险，而且需要终身治疗，只有基因疗法才有可能从根本上治愈血友病。从患者的外周血单核细胞 （PBMC）中诱导，形成iPSC细胞，构建了靶向AAVS1靶点的AAVS1-Cas9-sgRNA和AAVS1-EF1α-F9 cDNA-嘌呤霉素donor，并将它们通过电转导入iPSC中，成功地将人全长F9 cDNA敲入iPSCs的AAVS1位点。然后将 iPSC分化为肝细胞，发现该肝细胞可以稳定分泌人凝血因子IX （hFIX），并能够在短期内移植到非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷病（NOD/SCID）小鼠中，这为血友病的临床基因治疗提供了一种新方法。
图4. F9 cDNA插入HB iPSCs AAVS1位点[4]
iPSC细胞的双敲除技术揭示细胞凋亡机制
已有研究表明，BAX和BAK在小鼠胚胎生长过程中都是必不可少的，并且在人类癌细胞系中证实了BAX和BAK在细胞凋亡过程中线粒体裂变中的作用。但是由于缺乏合适的研究模型，BAX和BAK在人类大脑发育中的功能仍然难以捉摸。Joshi等在人诱导多能干细胞 （hiPSCs）、hiPSC衍生的神经祖细胞 （hNPCs）、神经玫瑰花结和大脑类器官中双敲除BAX/BAK基因，用来揭示BAX和BAK缺失在体外模型中的对人类大脑早期发育的影响。发现BAX和BAK缺陷细胞具有异常的线粒体形态并导致皮质结构异常。由此认为BAX和BAK在人类发育过程中的关键功能，包括维持线粒体形态的稳态，这对于皮质祖细胞和神经元的正常发育至关重要。
图5. BAX/BAK DKO hiPSCs细胞死亡表型的表征和验证[5]
看完以上的案例解析，大家对IPSC实验设计是否已经有了灵感，跃跃欲试了呢？然而IPSC基因编辑细胞的构建是个耗时的过程，特别是单克隆细胞的筛选，费事费力；而且想要最终拿到基因编辑效果彻底的IPS细胞并不容易，例如在构建的过程中，细胞培养条件的稍不注意便可能导致IPS细胞的分化。
参考文献：
[1] Zhu, Huang et al. “Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity.” Cell stem cell . 27,2 （2020）: 224-237.e6.
[2] Deneault, Eric et al. “Complete Disruption of Autism-Susceptibility Genes by Gene Editing Predominantly Reduces Functional Connectivity of Isogenic Human Neurons.” Stem cell reports.11,5 （2018）: 1211-1225.
[3] Kung, Louise H W et al. “Generation of a miR-26b stem-loop knockout human iPSC line, MCRIi019-A-1, using CRISPR/Cas9 editing.” Stem cell research. 50 102118. 10 Dec. 2020.
[4] Lyu, Cuicui et al. “Targeted genome engineering in human induced pluripotent stem cells from patients with hemophilia B using the CRISPR-Cas9 system.” Stem cell research & therapy vol. 9,1 92. 6 Apr. 2018.
[5] Joshi, Piyush et al. “Modeling the function of BAX and BAK in early human brain development using iPSC-derived systems.” Cell death & disease vol. 11,9 808. 25 Sep. 2020.