Nature Cell bio | 细胞分辨率外显子特异性亚型表达活体监测技术
撰文：风不止步
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亮点：
开发了一种外显子特异性异型表达报告系统(EXSISERS)，该系统通过高效、蛋白介导的蛋白剪接，无疮疤地从新生多肽链中切除报告蛋白，以非侵入式方式报道内源性基因的外显子特异性异型表达。
2021年6月3日，德国慕尼黑大学的Gil Gregor Westmeyer等人在《Nature Cell biology》上发表了一篇“Non-invasive and high-throughput interrogation of exon-specific isoform expression ”的文章。文章应用EXSISERS量化患者来源诱导的多能干细胞中微管相关蛋白tau (MAPT)中包含的疾病相关外显子10，并筛选基于cas13的RNA靶向效应子以获得亚型特异性。另外将细胞的存活与FOXP1的18b外显子的包含相结合，该外显子参与维持胚胎干细胞的多能性，并证实MBNL1是排除18b外显子的主导因素。EXSISERS能够以高灵敏度和细胞分辨率对外显子特异性亚型表达进行非破坏性和多模态监测，并能够对外显子特异性治疗干预进行高通量筛选。
>90%的基因存在选择性剪接，其损伤与脊髓性肌肉萎缩和帕金森病等疾病相关。已经建立分析剪接异构体的方法，通过端点标记(反转录定量PCR (RT-qPCR)，单分子荧光原位杂交(smFISH)和RNA测序；测量mRNA，使用单时间点免疫化学(免疫印迹分析，免疫荧光染色)或寻求模拟遗传规则使用微量基因分析。
目前用于检测亚型特异性表达的蛋白质水平的方法受到外显子特异性抗体的限制。相比之下，mRNA水平上的分析可能具有误导性。此外，RT-qPCR和RNA-FISH天生具有消耗性，阻碍了对活细胞的纵向分析。在经典的微型基因实验中，基因组序列的片段，特别是外显子-内含子片段，被复制到一个组成型启动子驱动的质粒中，并在细胞系中表达。微基因的剪接行为通过RT-qPCR或嵌入的报告基因读出。但其部分内含子/外显子基序可能在非自然水平上过表达，而必要的调控序列可能被截断。
此外，许多脊椎动物基因是递归剪接的，在微小基因中可能不被截短的内含子重新拼接。因此，内含子的长度是预测微基因的剪接行为有效性的一个重要参数，外显子的大小在体内实验设置中只起很小的作用。因此，通过包含多个外显子和全长内含子的大基因组片段来增加结构的大小，以更好地再现剪接缺陷将是一种趋势。然而，这些“midigenes”组装起来很麻烦，通常需要细菌人工染色体，而且限制了质粒转染的合理效率。
EXSISERS的核心概念是，在包含EOI后，选择的报告者或效应者被共同翻译，并通过有效的分裂蛋白剪接事件迅速释放，产生未修饰的蛋白亚型，从而保持原始的亚型比率(图1a,b)。（图1：人类MAPT外显子-10特异性亚型的自切除报告子比率读数）
接下来评估EXSISERS对MAPT第10外显子使用情况的无创成像和多时间点分析(图2a)。利用生物发光显微镜，将添加荧光素酶底物后的单个细胞拆分为2d，以在没有或没有MAPT诱导的情况下绘制细胞群体中发光信号的分布(图2b,c)。
（图2：MAPT亚型表达的实时成像和纵向读出。）
为了评估EXSISERS是否可以用于内源性tau蛋白表达的细胞，将EXSISERS敲入人诱导多能干细胞(hiPSCs)的MAPT中。然后，将其分化为皮质神经元，同时通过3个月的时间测量pan/4R-tau蛋白的表达(图3a,b)。在WT的MAPT中，观察到4R部分亚型表达如预期的逐渐增加。随后，分数异构体表达量在51d和81d非单调增加。这些数据显示了EXSISERS的比率、高敏感性蛋白水平读数如何使低成本、多时间点的亚型表达定量在少量宝贵的细胞培养模型中用于药理筛选。
（图3：hipsc衍生的EXSISERS系用于药理筛选）
当RfxCas13d配备核输出信号(NES)时，与核定位信号(NLS)相比，4R/pan-tau比值略有下降;图4 a, b)。然而，在我们的实验条件下，总体敲低(knockdown, KD)活性出人意料地仍然很弱，这是为转染低水平质粒而优化的。有趣的是，观察到RfxCas13d对4R-tau (NLuc)的抑制更有效，尽管以牺牲第10外显子的特异性为代价(图4 b)。当将扩展的30核苷酸间隔区与RfxCas13d-NLS结合时，与典型的22核苷酸CRISPR RNA (crRNA)相比，4R/pan-tau比值下降幅度最大。在未修饰的HEK293T细胞上使用RT-qPCR验证了这些结果，发现使用延长的30 bp crRNA, 4R/pan-tau比值显著降低(P=0.0397)。
（图4：优化Cas13d对MAPT的异构特异性扰动）
然后利用一种选择机制来鉴定FOXP1的剪接调节因子，并证实MBNL1是18b外显子内含物的显性抑制因子。还发现RNA解旋酶MOV10是一个辅助因子，这可能反映了它在提高剪接机制的可及性方面可能发挥的作用。
此外，使用EXSISERS对tau亚型进行无创量化，并显示出生理和疾病相关效应(4R-tau水平升高)可以通过高通量兼容比率荧光素酶测定和细胞分辨率的实时监测方便地读取出来。结果发现一种小分子抑制剂对MAPT外显子10内含的影响可以在HEK293T细胞、smNPCs和从hiPSCs生成的神经元中纵向监测，表明EXSISERS可以在相关细胞模型中高通量筛选3R/4R调控。
总之，EXSISERS是通过将快速剪接蛋白与CC结构域结合，以确保模块化效应蛋白的立即去除和未经修饰的内源性蛋白产物的无疤痕翻译而实现的。
教授介绍
教授，博士 GilGregor Westmeyer
神经生物学工程
Westmeyer 教授致力于开发用于细胞过程的功能成像和时空控制的分子成像和控制方法。生物和纳米技术方法与非侵入性成像技术一起使用，如磁共振断层扫描 (MRT) 或多光谱光声断层扫描 (MSOT)，辅以快速荧光成像。该方法用于类器官的动态分析和临床前模型生物的大脑活动，以研究细胞网络的功能并支持未来再生和细胞疗法的发展。
Westmeyer 教授在慕尼黑学习医学和哲学。他在 Christian Haass 教授的实验室撰写了关于阿尔茨海默病分子基础的论文，然后在哈佛医学院完成了部分临床培训。从 2005 年开始，Westmeyer 教授在麻省理工学院 Alan Jasanoff 教授的实验室进行研究，然后于 2012 年接任 TUM 医学院分子影像学教授职位。Westmeyer 教授还在 Helmholtz Zentrum München 领导一个分子成像和控制研究小组。
参考文献
1、Dong-Jiunn Jeffery Truong, Teeradon Phlairaharn et al.Non-invasiveand high-throughput interrogation of exon-specific isoform expression .(2021)