【生化】Angew：荧光探针用于实时监测活细胞线粒体中铂积累情况

顺铂（cDDP）与第二代基于铂（Pt）的药物卡铂和奥沙利铂是治疗睾丸癌、卵巢癌、肺癌和结直肠癌最有效的化疗药物之一。然而，cDDP在去核细胞中的高细胞毒性表明Pt药物具有非核靶标的问题，但其可通过靶向其他亚细胞器发挥细胞毒性，且线粒体DNA可能是靶标。因此，开发合适的方法用于在细胞内环境中监测Pt药物的加工及积累显得尤为重要。

基于此，新加坡国立大学的Wee Han Ang教授设计并合成了第一个可用于实时监测线粒体中Pt积累情况的线粒体靶向荧光探针Rho-Mito，并将其用于研究线粒体作为生物系统中抗癌Pt候选药物的细胞靶标。在该荧光探针中，罗丹明为荧光支架，二硫代氨基甲酸酯识别基团可与Pt^Ⅱ衍生物相结合，三苯基膦为线粒体靶向基团（Figure 1）。相关成果以“A Platinum-Selective Fluorescent Probe for Real-Time Monitoring of Cisplatin Accumulation in Mitochondria in Living Cells”为题发表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202010951）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

首先，作者基于Rho-Mito对Pt²⁺离子出色的光响应能力，探究了其对Pt^Ⅱ抗癌复合物（包括cDDP）的响应情况。研究结果显示，随着cDDP含量的增加，Rho-Mito的荧光强度（I₅₆₅）明显增加，且在0-100 μM的cDDP浓度之间呈现良好的线性关系（Figure2a）。除cDDP外，Rho-Mito对其他Pt^Ⅱ抗癌复合物（如JM118、吡铂、卡铂和菲铂）也有着良好的响应，但对含有螯合胺配体的Pt^Ⅱ抗癌化合物（如奥沙利铂、Pt(en)Cl₂）并没有产生响应（Figure 2b）。

基于Rho-Mito对cDDP良好的响应性以及在生理条件下的高选择性和稳定性，作者将其应用于活细胞中cDDP的荧光成像。在Hela细胞的荧光成像图中，可以看到Rho-Mito的红色荧光信号与线粒体商业探针Rh 123的绿色荧光信号具有很高的重叠，皮尔逊系数为0.82，重叠系数为0.88（Figure2c），这表明Rho-Mito可靶向线粒体并能用于检测活细胞中Pt^Ⅱ抗癌复合物的积累。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

其次，作者将Rho-Mito应用于实时监测活细胞线粒体中Pt的积累，以阐明转运蛋白系统对cDDP转运的影响。研究表明，铜伴侣蛋白COX17参与了cDDP转移至线粒体的过程，因此作者比较4小时内对照KD和COX17-KD（COX17敲除）细胞中cDDP的积累，发现COX17-KD细胞中cDDP的摄取持续降低（Figure 3, top）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

cDDP与COX17的直接结合被认为是线粒体运输的必要条件，因此作者探究了Pt^IV类似物cP-(PPh₃)₂和cP-(PPh₃)(OH)，其包含cDDP药效基团以及用于被线粒体摄取的TPP靶向基团（Chart 1）。作者假设这两种Pt^IV复合物由于其动力学惰性而对COX17不具有反应性，将绕过COX17介导的转运机制，利用Rho-Mito可以区分线粒体中的Pt^II和Pt^IV物种，从而确定形成细胞毒性Pt^II物种时的总递送速率。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

与预期的一样，化合物的平均荧光强度随时间的变化曲线表明，cP-(PPh₃)₂处理过的COX17-KD细胞与对照组KD细胞相比，Pt^II积累无显著差异（Figure 3c），这表明Pt运输与COX17无关。然而，当研究单功能化的cP-(PPh₃)(OH)时，作者发现与对照组KD细胞相比，COX17-KD细胞中Pt^II的积累减少了8%（Figure 3d），这表明线粒体转运部分依赖于COX17。实际上，对于cP-(PPh₃)₂，在对照组KD和COX17-KD细胞中， IC₅₀值没有显着差异（Figure 3c）。另外，cP-(PPh₃)(OH)在COX17-KD细胞中的细胞毒性比对照组KD细胞低1.3倍（Figure 3d），这与线粒体Pt积累减少一致。

随后，作者以一种类似Pt^IV的cP-(OBz)(OH)验证了Pt^IV配合物易通过H键网络以内球途径被还原（Chart 1）。与KD细胞相比，经cP-(OBz)(OH)处理的COX17-KD细胞的Pt^II积累降低了22％（Figure 3b）。IC₅₀值分析表明，cP-(OBz)(OH)在COX17-KD中的细胞毒性比对照KD细胞小2.1倍（Figure 3b），并保持了较低的线粒体Pt积累。同样的，在另一对Pt^IV复合物，即cP-(OAc)₂和cP-(OAc)(OH)中也观察到了类似的趋势。cP-(OAc)₂在对照KD细胞和COX17-KD细胞之间的Pt^II积累和IC₅₀值上均没有显示出显著差异（Figure 3e），而更容易还原的cP-(OAc)(OH)在COX17-KD细胞中的Pt^II积累减少了14％，细胞毒性则降低了1.4倍（Figure 3f）。

除了cDDP及其Pt^IV前药外，作者还观察到Pt^ll复合物（如吡铂和卡铂）也是通过COX17介导的途径吸收的。吡铂和卡铂在COX17-KD细胞中的Pt^II积累分别降低18％和10％（Figure 4）。类似的，较低的线粒体Pt积累导致吡铂和卡铂在COX17-KD中的细胞毒性分别比对照KD细胞低1.7倍和1.3倍（Figure 4c）。

（来源：Angew. Chem. Int. Ed.）

总而言之，作者开发了第一个靶向线粒体的荧光探针Rho-Mito，用于实时监测线粒体中cDDP的积累并证明了COX17介导了cDDP向线粒体的传递。另外，Rho-Mito还可用于监测cDDP的Pt^IV前药以及其他Pt^II类似物的实时激活；对cDDP支架的结构修饰可以直接影响其与COX17的结合，影响通过COX17介导途径的转运。