魔高一尺，道高一丈！清华大学徐萌团队发现能量代谢与肿瘤免疫逃逸的关系
以下文章来源于丁香学术 ，作者tRNA
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目前有研究发现，肿瘤细胞可以通过组蛋白修饰、DNA 甲基化和染色质结构改变等协同作用，通过表观调控实现免疫逃逸。前期研究发现动态可逆的 RNA m6A 甲基化与肿瘤发生和转移之间存在密切联系。考虑到 m6A 甲基化的可逆性，研究团队推测肿瘤会通过调控 m6A 甲基化过程来改变肿瘤微环境。然而，肿瘤自身的（Tumor intrinsic） RNA 表观转录组是否参与免疫逃逸仍是未知的。
2021 年 4 月 27 日，清华大学徐萌团队联合中科院北京基因组研究所韩大力团队，中科院上海药物研究所杨财广团队共同在 Cell 子刊 Cell Metabolism 发表题为 Tumors exploit FTO-mediated regulation of glycolytic metabolism to evade immune surveillance 的研究论文。
图片来源：Cell Metabolism
研究内容
肿瘤细胞的 FTO 缺失通过增强浸润 T 细胞来抑制肿瘤生长
研究人员首先分析了 TCGA 数据库的黑色素瘤（SKCM）数据，利用五个基因（CD8A, CD8B, GZMA, GZMB, and PRF1）定义了 cytotoxic T lymphocyte (CTL) score，反映肿瘤浸润 CD8+ T 细胞的功能。
研究发现在表观转录组调控因子中，RNA 去甲基化酶 FTO 与 CTL score 呈现负相关。为了检测肿瘤细胞的 FTO 表达是否影响 T 细胞介导的抗肿瘤功能，研究人员在 B16-OVA 黑色素瘤细胞和肺癌细胞系 LLC 中对 FTO 进行敲降。研究人员将 B16-OVA 和 LLC 接种到小鼠体内，发现 Fto-Kd 细胞产生的肿瘤生长速度明显减慢。
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为进一步评估适应性免疫应答在抑制肿瘤生长中发挥的作用，研究人员将 Fto-Kd 肿瘤细胞接种在免疫缺陷 Rag2-/- 小鼠中，发现对照细胞和 Fto-Kd 的肿瘤体积相同，表明 Fto-Kd 介导的抑制肿瘤与适应性免疫应答相关。
研究人员通过流式细胞术分析了肿瘤浸润的骨髓衍生细胞（单核细胞，巨噬细胞和树突细胞）和 T 细胞，发现在 Fto-Kd B16-OVA 和 LCC 肿瘤中 CD4 + 和 CD8+ T 细胞浸润明显增加。测定 IFN-γ 和 granzyme B 的产生来评估肿瘤浸润性 CD8+ T 细胞的功能，发现 Fto-Kd 肿瘤细胞 IFN-γ 和 granzyme B 阳性的 T 细胞增多。
这些结果表明在肿瘤中 FTO 的缺失导致 CD8+ T 细胞浸润和其介导的细胞毒性增加。
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肿瘤固有 FTO 限制 CD8+ T 细胞的激活和效应状态
为检测肿瘤固有 FTO 对 T 细胞的影响，研究人员对 B16-OVA 细胞和 抗原特异性 CD8+T 细胞进行共培养，随后通过流式对 CD8+ T 细胞进行分选并进行 RNA-seq。
转录组分析显示，FTO 敲降导致 CD8+ T 细胞发生显著改变：1420 个基因上调和 1101 个基因下调。其中细胞因子和细胞毒性分子（IL-2, IFN-γ 和 granzyme B）的表达增加。通过对 CD8+ T 细胞效应特征基因进行基因集富集分析发现，Fto-Kd 导致 T 细胞激活并且增加了 T 细胞杀伤效果。
这些结果表明肿瘤固有的 FTO 功能作为抑制因子，限制了 T 细胞的激活和效应状态。
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FTO 缺失抑制糖酵解
肿瘤通常利用糖酵解来促进自身快速生长，同时肿瘤细胞消耗葡萄糖会限制 T 细胞代谢，通过直接抑制其效应功能，从而促进肿瘤恶化。为检测 FTO 是否通过改变糖酵解从而限制 T 细胞的激活，研究人员测定了肿瘤细胞糖酵解的能力，发现 Fto-Kd 细胞显著降低癌细胞糖酵解的能力。
研究人员通过 RNA-seq 探究 Fto-Kd 如何抑制糖酵解能力，发现在 Fto-Kd 细胞中，糖酵解途径相关基因明显下调。由于 MYC 和 bZIP 家族转录因子可以转录激活糖酵解基因，研究人员发现 Kto-Kd 细胞中 bZIP 家族转录因子 Jun，Cebpb 和 Junb 在 RNA 和蛋白水平均发生下调。为了验证转录因子与 T 细胞活化的关系，研究人员在 Fto-Kd 细胞中过表达 Junb，发现抑制了 T 细胞活化，而使用 2-DG 阻断肿瘤糖酵解后，抑制的 T 细胞活化明显被恢复。
这些结果表明 Fto-Kd 通过抑制糖酵解转录因子导致 T 细胞活化增强。
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FTO 通过 m6A 依赖的方式调控 bZIP 转录因子
为进一步探究 FTO 与转录因子之间的调控关系，研究人员对 B16-OVA 肿瘤细胞进行 M6A-seq。通过计算每个峰 m6A 比率，研究人员发现 Fto 敲降导致 m6A 甲基化整体增加。研究人员进一步挑选了 83 个 FTO-m6A 直接调控基因进行 GO 分析，发现 DNA 结合和转录激活显著富集，包括 bZIP 转录因子 Jun 和 Cebpb。
为了分析这些 mRNA 中 m6A 增加是否与 FTO 直接相关，研究人员在肿瘤细胞中过表达了 CRISPR-dCas13 融合蛋白，发现在 gRNA-Cebpb-JunB 和 dCas13b-FTO 共转染时，JunB 和 C/EBPβ 及下游糖酵解基因显著上调，这些结果表明 FTO 通过去甲基化 Junb 和 Cebpb 来调控下游糖酵解基因。
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Dac51 是一种有效的 FTO 抑制剂
已有报道表明 FTO 抑制剂具有明显的抗肿瘤效果，然而目前还没有研究探究在免疫肿瘤微环境中使用 FTO 抑制剂激活 T 细胞。因此，研究人员优化了 FTO 抑制剂得到了 Dac51。体外实验表明，Dac51 对 FTO 去甲基化活性具有良好的抑制活性。
此外，研究人员还测定了 FTO 和 Dac51 配合物的晶体结构，发现 Dac51 的异羟肟酸与 Ser229 之间存在额外的氢键，可能导致 Dac51 与 FTO 的结合显著增强。Dac51 处理与 Fto 敲降对糖酵解代谢的抑制水平相似。
这些结果表明 Dac51 可以作为一种有效的 FTO 抑制剂，通过抑制 FTO 介导的 Jun 和 Cebpb 转录本的去甲基化，抑制肿瘤细胞的糖酵解能力。
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Dac51 治疗增加了 T 细胞浸润，并与 PD-L1 抗体具有协同作用
为了确定 Dac51 是否具有类似 Fto 敲降的抗肿瘤作用，研究人员进行体外共培养试验。在与 Dac51 预处理的 B16-OVA 肿瘤细胞共培养的 T 细胞中，发现细胞因子释放增强，细胞毒性提高。研究人员探究 Dac51 对患者来源类器官（patient-derived organoids，PDOs）的影响时发现，Dac51 处理后 c-Jun，C/EBPb 和 JunB 表达降低，编码糖酵解酶基因（LDHA 和 PFKP）同样下调，而 T 细胞激活增加。
为评估 Dac51 对体内肿瘤模型的抗肿瘤作用，研究发现 Dac51 治疗可有效的抑制肿瘤在体内生长。此外，研究人员还探究了 Dac51 和免疫检查点阻断剂联合治疗的效果，发现联合治疗肿瘤生长减慢，小鼠总体生存期延长。
这些结果表明，强效的 FTO 抑制剂 Dac51 可传递 T 细胞介导的抗肿瘤作用，并通过记忆 T 细胞反应防止肿瘤复发。
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研究总结
本研究证明 Dac51 可以作为 FTO 抑制剂并阻碍 Jun，Junb 和 Cebpb 的表达，从而防止已知的破坏肿瘤内 T 细胞效应功能的代谢限制。提出了 Dac51 和 T 细胞功能增强子结合，如检查点阻断剂和其他免疫原性传统疗法，可能是协调改善适应性免疫应答的有效策略。研究人员发现 RNA 转录组可以作为免疫逃避的另一层遗传调控，这将有助于发现一类潜在的转录组免疫治疗靶点。
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延申阅读
早在 2019 年，韩大力教授团队，徐萌教授团队以及美国芝加哥大学何川教授团队就在 Nature 杂志联合发表了题为 Anti-tumour immunity controlled through mRNA m6A methylation and YTHDF1 in dendritic cells 的研究论文， 该论文阐明了 RNA m6A 修饰通过调控树突状细胞的溶酶体组织蛋白酶翻译效率，影响肿瘤抗原特异性的 T 细胞免疫应答新机制。
m6A 修饰是 mRNA 上丰度最高的修饰类型，负责对 mRNA 分子进行转录后调控。作为一种新的表观遗传学调控，mRNA 甲基化相关研究在转录调控，疾病治疗等众多领域都有着广阔的研究前景。