自噬的分类及常规检测方法
自噬（autophagy）是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体（autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。
自噬的形成
细胞质中的线粒体等细胞器被称为“隔离膜”的囊泡所包被,这种“隔离膜”主要来自于内质网和高尔基体;囊泡终形成双层膜结构,即自吞噬体(autophagosome),也称之为初始自体吞噬泡(initial autophagic vacuoles , AVi);自吞噬体与胞内体融合形成中间自体吞噬泡(intermediate autophagic vacuoles, AVi/d);终自体吞噬泡的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡(degrading autophagic vacuoles, AVd),由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。在整个自体吞噬过程中,细胞质和细胞器都受到破坏,明显的是线粒体和内质网受损。虽然自体吞噬并不直接破坏细胞膜和细胞核,但是有证据表明,在初断裂或消化后,细胞膜和细胞核会终变成溶酶体以消化和分解自身。
在分子水平，自噬形成过程涉及mTOR等信号通路以及自噬形成过程中ATG基因的表达和LC3蛋白从LC3- I（包浆型）到LC3- II（自噬体膜型）的转换。
自噬的分类
根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同，自噬分为以下几种。
①大自噬：由内质网来源的膜包绕待降解物形成自噬体，然后与溶酶体融合并降解其内容物；
②小自噬：溶酶体的膜直接包裹长寿命蛋白等，并在溶酶体内降解；
③分子伴侣介导的自噬（CMA）：胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体腔中，然后被溶酶体酶消化。CMA 的底物是可溶的蛋白质分子，在**蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。
自噬的特性
（1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
（2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。
（3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。**是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。
（4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
（5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。
（6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来。由于自噬研究的历史关系，很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。
自噬的调控
**干预：
（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：mTOR抑制剂
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：溶酶体腔碱化剂
RNAi干扰
通过siRNA干扰Atg或者Beclin1等基因的表达，导致细胞自噬功能的缺失，基因干扰与通过**抑制相比，特异性更强
自噬的研究
电镜观察▬自噬研究直观的检测手段
电镜下可以观察到双层膜的自噬体和单层膜的自噬溶酶体结构，其中包裹着未被降解的包浆成分。该方法虽然可以直观的观察到自噬体的存在，但难以准确反应自噬活性的强弱
自噬染色▬一般用MDC和AO染色来检测自噬
单丹磺酰尸胺（monodansylcadaverin, MDC）是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长 355nm。阻断滤光片波长 512nm。MDC 是一种嗜酸性染色剂，通常被用作检测自噬体形成的特异性标记染色剂。
吖啶橙(AO)是一种特异性染料，激发滤光片波长488nm ，它能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光，也可以渗透进入酸性细胞器如自噬溶酶体，由于其对PH的敏感性，当PH较低时，AO发出红色荧光。
LC3检测▬LC3- I（包浆型）到LC3- II（自噬体膜型）的转换
利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
荧光蛋白-LC3▬直接观察自噬流的方法
GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻
RFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。自噬诱导后，融合表达的荧光蛋白-LC3蛋白锚定于自噬体膜上并与自噬体一起与溶酶体融合。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，溶酶体内的酸性环境可以导致GFP荧光信号猝灭，而RFP是稳定的荧光表达基团，不受外界酸性环境影响。由于自噬小体进入**阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，自噬体和自噬溶酶体分别成绿色和红色标记，因此，如果自噬潮增加，两种颜色的点状聚集均增加，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，如果黄色点状聚集增加，红色不增加，则自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体成熟进程受阻。该技术实现了自噬体向自噬溶酶体转化步骤的观察。
其他自噬相关蛋白的检测▬自噬的常规检测方法
目前已发现30多个与自噬相关的特异性基因，这些基因目前统一命名为autoophagy-related gene(ATG)。另外一些自噬标记蛋白如Beclin1和P62（SQSTM1）的检测同样可以为自噬的发生提供依据。