环状RNA CircFndc3b通过FUS/VEGF
原创 李纪伟 上海生命基因
环状RNA CircFndc3b通过FUS/VEGF-A轴调节心肌梗死后的心脏修复
发表单位：坦普尔大学Lewis Katz医学院
师弟：最近的circRNA研究好热门！我看到好几篇circRNA相关的文章都发表在高分杂志上，也好想试试circRNA机制分析。师兄，听说你很精通circRNA分析，你能介绍一下circRNA文章的高分秘籍吗？
师兄：好啊。我这里刚好有一篇10+分的circRNA机制的文章，我们一起看一看作者是如何做的吧。
摘 要
环状RNA是由许多蛋白质编码基因产生的，但是它们在心血管健康和疾病状态中的作用仍然未知。在这里，我们报告鉴定在心肌梗死后（MI）小鼠心脏中差异表达的circRNA转录物，其中包括circFndc3b，其在MI后心脏中明显下调。在缺血性心肌病患者的心脏组织中，人circFndc3b直向同源物也显着下调。circFndc3b在心脏内皮细胞中的过表达增加了血管内皮生长因子-A的表达，并增强了它们的血管生成活性，并减少了心肌细胞和内皮细胞的凋亡。MI后circFndc3b过度表达减少心肌细胞凋亡，增强新血管形成并改善左心室功能。从机理上讲，circFndc3b与融合在肉瘤中的RNA结合蛋白相互作用，调节VEGF的表达和信号传导。这些发现突出了circRNA在心脏修复中的生理作用，并表明circFndc3b表达的调节可能代表了MI后促进心脏功能和重塑的潜在策略。
师兄：阅读文献时理清文章的分析流程十分重要，我简单整理了一下文章的逻辑脉络，就能更清晰地理解文章的内容。
师弟：谢谢师兄！
结 果
1 、小鼠心脏模型的CircRNA分析
师兄：作者对小鼠心脏进行circRNA芯片分析，鉴定MI后的差异表达circRNA，其中circFndc3b的表达量显著下调，而qPCR验证其mRNA不差异表达。并且人的同源物也在患者中具有相似的差异变化，表明circFndc3b与MI相关。
下图是对照和心肌梗死心脏的CircRNA谱。处理组和对照组在不同时间与原始样品的circRNA的表达量差异变化表现为从蓝色增加到红色。热图是差异分析中十分常见，运用不同的颜色将基因表达量的差异直观地展示出来。
师弟：文章中使用了circRNA芯片定量circRNA，其他文献有时候还用到RNA-seq测序进行定量分析，那么师兄，基因芯片和RNA-seq之间有什么区别呢？我们应该如何选择呢？
师兄：基因芯片和RNA-seq都可以用于circRNA的定量，只不过基因芯片只包含已经鉴定的circRNA，而RNA-seq有时能鉴定出新的circRNA。现在circRNA的研究才刚刚起步，有大量circRNA还未鉴定，同时如果是不常用的物种就缺少相关的circRNA信息，很难通过基因芯片定量，所以我还是建议通过RNA-seq的方法定量circRNA。这里使用的是小鼠模型进行研究，所以可以使用基因芯片进行定量。
师弟：那这里的同源物分析是什么？作者为什么要进行同源物分析呢？
师兄：同源物就是共同祖先在不同物种遗传的基因，他们的序列之间拥有一定的相似性，并且功能上的作用可能也相关。这里作者进行同源物分析其实也是一种对差异表达的circRNA的筛选，在人的同源物也与心脏疾病相关说明其更有可能发挥重要作用。
下图是人和小鼠circFndc3b序列的成对比对结果，相似率达到86.5%。
2、 circFndc3b的过表达增强内皮细胞功能并减少心肌细胞凋亡
师兄：确定了circFndc3b作为研究对象，首先就需要对circFndc3b的环状结构进行验证。作者通过Sanger测序、RNase R处理验证了circFndc3b在Fndc3b基因的外显子2和3的反向连接。
师弟：嗯。鉴定circRNA的靶基因是研究circRNA的功能机制的关键一步，这篇文章是如何找到circFndc3b靶基因的呢？
师兄：本文是通过circFndc3b过表达后使用基因芯片分析差异基因，并通过qPCR筛选出circFndc3b可能的靶基因VEGF-A，根据VEGF-A已知的功能，体外实验验证circFndc3b的功能。基因芯片中包含了与血管生成相关的基因。也就是说，通过敲低和过表达的基因表达量变化与相关的功能结合筛选circRNA的靶基因。
下图是显示血管生成基因芯片的对照和circFndc3b过表达的差异表达基因的热图。
3、 CircFndc3b过表达减轻LV功能障碍并增强新生血管形成减少纤维化
师兄：接下来，作者通过circFndc3b的过表达实验验证了其在心脏和血管相关的作用。体外实验发现circFndc3b改善了LV功能障碍，并促进血管生成，减少梗死面积。
4、 circFndc3b发挥功能的途径不是与miRNA结合，而是通过circFndc3b-FUS-VEGF-A信号网络
师兄：这里为了研究circFndc3b是如何靶向靶基因VEGF-A，如何发挥功能的，作者首先验证了其作为miRNA海绵的作用。预测了circFndc3b与miRNA的结合位点，并通过荧光实验验证了circFndc3b与3个miRNA有互作。将circFndc3b与靶标miRNA结合位点突变，发现circFndc3b的功能没有显著变化，说明circFndc3b的主要功能可能不是与miRNA结合发挥的。
师弟：这里没有验证出circFndc3b有miRNA海绵的功能，为什么还需要将这些结果发表出来呢？
师兄：miRNA海绵是常见的circRNA功能，从这里我们可以总结出一般circRNA的miRNA海绵功能的研究与验证过程。首先使用预测软件预测与circRNA相互作用的miRNA，然后利用荧光实验验证circRNA与miRNA的相互作用，最后通过circRNA突变或者miRNA的敲低过表达实验验证miRNA参与circRNA的功能。
师弟：我明白了！那circFndc3b发挥功能不是通过与miRNA结合，那会是通过什么机制呢？
师兄：除了充当miRNA海绵外，circRNA还会通过与RNA结合蛋白相互作用而发挥功能。作者进一步预测circFndc3b与RNA结合蛋白的互作，通过实验验证了circFndc3b与FUS的结合，并且FUS的功能与circFndc3b的功能相关。通过circFndc3b和FUS的敲低过表达实验发现靶基因VEGF的表达变化，于是构建了circFndc3b与FUS的互作调控VEGF表达的互作网络，并通过敲低和过表达实验验证了该通路在体内也调控VEGF的表达，进而调节梗死后的心脏修复。
师弟：那么研究circRNA与RNA结合蛋白互作有没有什么套路呢？
师兄：RNA结合蛋白虽然种类不多，但在转录调控相关的过程中发挥重要作用。一些RNA结合蛋白（RBP）可以与circRNA结合，造成circRNA及其同源mRNA之间的竞争，从而影响翻译。一般我们可以利用pull-down实验和RNA免疫共沉淀（RIP）验证RNA分子与蛋白的互作。
讨 论
师弟：谢谢师兄为我介绍了这么多！你对现在circRNA分析怎么看？
师兄：circRNA在疾病的基因调控过程中发挥着重要作用，现在还有许多circRNA没有鉴定，很多circRNA的功能也不了解，所以现阶段是circRNA发高分文章较容易的时期。以本篇文章为例，作者揭示了circFndc3b的外源传递在减轻MI后小鼠左心室功能障碍中起重要作用，并验证了其通过FUS / VEGF信号传导机制表现出心脏保护作用。下图为circFndc3b介导的心脏修复机制。
材料方法
环形RNA芯片
对分别从MI和对照小鼠心脏（n＝2）提取的总RNA进行CircRNA表达分析。原始表达强度被log2转化并通过分位数归一化。差异表达阈值为p≤0.05和| FC |≥2.0。
资料可用性
基因表达综合（GEO）提供了支持这项研究结果的芯片数据，登录号为GSE133503。
师兄：这篇文章主要内容都是围绕研究circFndc3b的功能机制展开的，所需要的实验主要包括处理组和对照的基因芯片、敲低和过表达等功能实验以及生物大分子互作筛选等机制验证，是值得学习的circRNA机制文章。你所问的高分秘籍就在于circRNA机制的一般研究方法，比如验证与circRNA互作的分子、筛选受circRNA调控的下游基因和通路、构建ceRNA网络等等，环环相扣，逻辑严密，发一篇高分文章并不是什么困难的事！
师弟：师兄，听了你的讲解，我终于把这篇文章理解了。你怎么会知道的这么多啊？
师兄：师弟，这就需要平时多看文献多做总结了。我向你推荐一个超好用的公众号：上海生因生物。这个公众号定期发布关于circRNA和RNA-seq相关的文献解读和干货视频，还提供免费的分析服务。