原代细胞培养操作步骤

原理：将动物机体的所有组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置适宜的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程之为称原代细胞培养。

操作步骤

（一）胰酶消化法

1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，放入75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和**浸入体内）然后用碘酒**腹部，取胎鼠带入超净台内（或者将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。

2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。

4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。

6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。

8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。

10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 上述消化分离的方法是基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。

（二）组织块直接培养法 自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养